左歸丸對去勢大鼠鈣轉運通路相關蛋白的影響

　　〔摘要〕 目的 探討左歸丸去勢大鼠骨密度和骨、腎組織中鈣轉運通路相關蛋白的影響。方法 選取48只雌性SD大鼠，隨機分為正常組，假手術組，模型組，西藥組，中藥低、高劑量組。除假手術組和正常組，其余組切除大鼠卵巢，造模成功后3個月進行各組干預。3個月后處死大鼠，檢測大鼠骨密度(BMD);Western blotting法檢測鈣轉運通路(腎組織)蛋白表達;免疫組化檢測去勢大鼠骨組織中新型上皮鈣通道5(TRPV5)蛋白的表達。結果 與模型組相比，左歸丸高劑量組與西藥組大鼠骨密度均有改善(P<0.05);與假手術組比較，模型組各蛋白表達均有不同程度下降(P<0.01，P<0.05);尼爾雌醇和左歸丸均能不同程度上調去勢大鼠腎組織中TRPV5蛋白、鈉鈣交換器(NCX1)蛋白、鈣結合蛋白-D28K(CaBP-D28K)和細胞膜鈣汞(PMCA1b)蛋白表達，差異均具有統計學意義(P<0.05，P<0.01);免疫組化顯示模型組較假手術組的TRPV5蛋白表達率增加(P<0.05)，而西藥組和中藥高、低劑量組較模型組蛋白表達率均下降(P<0.05)。結論 左歸丸可通過上調腎鈣轉運通路中相關蛋白的表達和降低大鼠破骨細胞中TRPV5蛋白的表達，而發揮骨質疏松癥治療作用，腎、骨組織中鈣轉運過程相關蛋白可能成為骨質疏松癥治療的新方向、新靶點。

　　〔關鍵詞〕 左歸丸;去勢大鼠;鈣轉運通路

　　《中文科技期刊數據庫(文摘版)醫藥衛生》簡稱《醫藥衛生》是經國家新聞出版廣電總局2009年4月8日批準的國家級電子學術教育期刊。

　　近幾年骨質疏松的發病人數在我國已經明顯上升，在60～70歲階段，約33%的女性和20%的男性患有該疾病，骨質疏松流行病對中老年人的生命安全、身體健康等形成一定的危害與威脅[1]。到2050年中國骨質疏松癥或骨密度低的患者將達到2.12億[2]，骨質疏松癥歸屬于中醫學“骨痿”“骨痹”范疇。中醫學認為，腎主骨，腎虛是絕經后骨質疏松癥發生的始動病機[3-4]，腎精盛衰直接決定機體生、長、壯、老、已的生命活動狀態。而骨的生長發育狀況也直接與腎精盛衰密切相關。左歸丸是滋陰補腎、填精益髓的名方，實驗研究證明，左歸丸具有類雌激素作用，能促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞的活性，維持二者的動態平衡，為中醫“腎主骨”理論提供了有利的實驗依據[5-6]。瞬時性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)家族成員新型上皮鈣通道5(TRPV5)是已知TRP中鈣離子高選擇性通道[7]，它在機體鈣離子跨上皮轉運方面發揮重要作用，參與調節整個機體的鈣平衡。其介導的腎鈣及骨鈣轉運過程與骨質疏松癥的鈣代謝紊亂有著密切的聯系。本研究擬基于TRPV5介導的鈣轉運通路(腎組織、骨組織)探討補腎經典方劑左歸丸對骨質疏松癥模型大鼠的療效及作用機制。

　　1 材料

　　1.1 動物與藥物

　　6月齡雌性SPF級SD大鼠48只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物治療合格證號43004700022760。左歸丸配方：熟地黃24 g，山藥12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟絲子12 g，鹿膠12 g，龜膠12 g(由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科提供)，將藥物水煎2次，合并濾液并濃縮致0.48 g(生藥量)/mL(相當臨床等效劑量)、1.92 g(生藥量)/mL濃度的藥液(相當于臨床4倍量)。尼爾雌醇(購自上海醫藥(集團)有限公司新華聯制藥廠生產，國藥準字：H31021647，規格2 mg/片)。

　　1.2 主要試劑

　　TRPV5(貨號17322-1-ap)、CaBP-D28k(貨號14479-1-ap)、NCX1(貨號55075-1-ap)兔抗體均由(美國)proteintech公司提供;β-actin鼠抗體(貨號60008-1-Ig)、PMCAIb(貨號ab190355)兔抗體購自英國abcam公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG購自美國Proteintech公司;中性樹膠購自Sigma公司;蘇木素、PBS(PH7.2-7.6)和枸櫞酸鹽緩沖液購自Wellbio公司;二步法試劑盒、DBA試劑盒購自中杉金橋公司。

　　1.3 主要儀器

　　電泳儀(美國Bio-rad公司);蛋白酶抑制劑(德國Merck公司);臺式高速冷凍離心機(中國深圳黑馬公司);全自動酶標洗板機和多功能酶標分析儀(匯松公司);電泳槽(中國北京六一公司);轉膜儀(中國北京六一公司);包埋機(常州中威電子儀器公司)、顯微鏡(Motic公司)。

　　2 方法

　　2.1 分組

　　將大鼠隨機分成左歸丸高劑量組、左歸丸低劑量組、西藥組、模型組、正常組及假手術組，每組8只。除假手術組和正常組，其余組均切除大鼠雙側卵巢復制絕經后大鼠骨質疏松動物模型。

　　2.2 造模

　　造模方法參照文獻[8]，10%水合氯醛溶液對大鼠按0.33 mL/100 g體質量腹腔注射進行麻醉，將假手術組大鼠背部切開，進入腹腔，將卵巢找到，從其旁將一定量的脂肪(1 g左右)剪除。將切除卵巢組大鼠距脊柱外側約1 cm與背部腋中線交叉部位的皮膚切開，腹腔打開，行兩側卵巢摘除術。傷口消毒7 d，觀察傷口愈合情況。

　　2.3 給藥劑量及方法

　　6組大鼠自由攝食、飲水，術后3月行活體骨密度(bone mineral density， BMD)檢測驗證模型復制成功，進行分組治療干預。按70 kg的成人一天服用左歸丸的生藥量為105 g計算，人的給藥量為1.5 g/(kg·d)，按照動物與人體表面積換算法，大鼠的臨床等效給藥量應為9.45 g/(kg·d)。每組大鼠的給藥體積均為20 mL/(kg·d)，根據大鼠每日給藥量與給藥體積，制備左歸丸低濃度煎劑為0.48 g生藥/mL(相當于臨床等效給藥量)、左歸丸高濃度煎劑1.92 g生藥/mL(相當于臨床4倍量)。

　　中藥低劑量組給予左歸丸低濃度煎劑(0.48 g/mL)，體積為20 mL/(kg·d);中藥高劑量組給予左歸丸高濃度煎劑(1.92 g/mL)，體積為20 mL/(kg·d);西藥組給予尼爾雌醇1 mL/(kg·d)灌胃，使用前配成混懸液(濃度為0.167 mg/mL)，1次/周，其余時間予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃;假手術組和模型組的大鼠給予體20 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃飼服。以上干預治療均持續3個月。

　　2.4 腎樣品和股骨頭的標本制備

　　腎樣品制備：剪取大鼠0.25 g腎組織，用冰預冷PBS洗組織，加入200 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復研磨組織直至看不見組織塊，以備Western Blot法檢測大鼠腎組織中TRPV5介導的鈣轉運通路相關蛋白的表達。

　　股骨樣品制備：將大鼠肌肉筋膜(附著在右后肢股骨)剔掉，以便進行大鼠樣本骨密度檢測。剪碎大鼠樣本的暴露股骨(即大鼠左后肢股骨干骺端)，以備免疫組化測試骨樣本骨組織中TRPV5蛋白的表達。