shRNA干擾URG11表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型影響

　　[摘要] 目的 研究上調(diào)基因11(URG11)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞(MG63)惡性表型的影響。

　　《東方食療與保健》OrientalDiet-TherapyandHealthCare(月刊)是我國目前唯一的一份以介紹藥膳食療內(nèi)容為主的科普性期刊，它填補(bǔ)了我國藥膳食療刊物的空白。

　　方法 用URG11短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒感染細(xì)胞，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)干擾效果。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移，Western blot檢測(cè)裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和波形蛋白(Vimentin)等表達(dá)。

　　結(jié)果 URG11 shRNA重組慢病毒感染MG63細(xì)胞后，URG11表達(dá)下降，差異有顯著性(F=181.200、97.307，P<0.001);細(xì)胞存活率、侵襲和遷移數(shù)量降低，細(xì)胞凋亡率升高，E-cadherin、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，Vimentin、MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，差異均有顯著性(F=28.064～625.516，P<0.05)。

　　結(jié)論 shRNA干擾URG11表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

　　[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤;上調(diào)基因11;腫瘤侵潤;細(xì)胞運(yùn)動(dòng);細(xì)胞凋亡

　　骨肉瘤是一種好發(fā)于青壯年和青少年的惡性骨腫瘤[1]，其惡性表型如增殖、凋亡、侵襲等與細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)基因有關(guān)[2]。上調(diào)基因11(URG11)是近年來發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖等過程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中發(fā)揮癌基因作用，下調(diào)URG11腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力減弱[4-5]。URG11在骨肉瘤組織中呈陽性表達(dá)，且與腫瘤病人分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，但其在骨肉瘤細(xì)胞中的作用尚不明確[6]。本實(shí)驗(yàn)通過干擾URG11的表達(dá)，探討URG11對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型的影響，為靶向URG11治療骨肉瘤提供依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞和試劑

　　骨肉瘤細(xì)胞MG63購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司;polybrene購自美國Sigma公司;SYBR定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;陰性對(duì)照慢病毒和URG11短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建;基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)抗體、URG11抗體購自美國Abcam;裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、

　　裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。

　　1.2 慢病毒感染

　　骨肉瘤細(xì)胞以每孔5×104個(gè)接種6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度為40%時(shí)，以MOI=20分別添加慢病毒，再加入適量的polybrene(終濃度為5 mg/L);培養(yǎng)12 h以后，加入新鮮培養(yǎng)液;培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，以1 mg/L的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。把不感染慢病毒的細(xì)胞設(shè)置為Control組(A組)，把感染陰性對(duì)照慢病毒以及URG11 shRNA重組慢病毒的細(xì)胞分別設(shè)置為shRNA-NC(B組)、URG11 shRNA(C組)。

　　1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定干擾效果

　　A、B、C組細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR。所用引物種類及其序列見表1。用SYBR定量PCR試劑盒分析URG11表達(dá)變化，計(jì)算方法為2-△△CT法，內(nèi)參為β-actin。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)測(cè)定干擾效果

　　A、B、C組細(xì)胞分別用PBS洗滌2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度，每孔30 μg蛋白樣品，設(shè)置120 V的電壓電泳2 h后，從玻璃板中間取出凝膠。將PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜置于4 ℃條件進(jìn)行。將PVDF膜置于新配置的含體積分?jǐn)?shù)0.05牛血清蛋白溶液中，在室溫結(jié)合2 h。把URG11一抗按1∶800倍稀釋，PVDF膜置于一抗反應(yīng)液中孵育過夜。再將二抗按1∶2 000倍稀釋后，把PVDF膜置于二抗反應(yīng)液內(nèi)孵育2 h。使用ECL發(fā)光。采用Image J分析內(nèi)參β-actin和目的條帶URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖

　　A、B、C組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL細(xì)胞培養(yǎng)液至每個(gè)孔內(nèi)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL的二甲基亞砜，混合反應(yīng)后，經(jīng)空白孔調(diào)零。以酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，把Control細(xì)胞的存活率設(shè)置為100%，分析其他各組細(xì)胞存活率變化。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

　　A、B、C組細(xì)胞中分別添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.7 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移

　　A、B、C組細(xì)胞以不含血清的培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞密度調(diào)整為7×107/L，分別添加到Transwell小室的上室內(nèi)進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。每組添加200 μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)添加500 μL的含血清培養(yǎng)液。24 h后，將小室取出，把沒有穿膜的細(xì)胞擦掉并以PBS洗滌后，分別添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目。在侵襲實(shí)驗(yàn)前以基質(zhì)膠將Transwell小室濕化，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)變化

　　A、B、C組細(xì)胞按照1.4中Western blot方法檢測(cè)Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表達(dá)變化。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.9 統(tǒng)計(jì)分析

　　采用SPSS 21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 URG11 shRNA下調(diào)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中URG11表達(dá)水平影響