反硝化作用是生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中一個(gè)重要的組成部分，能夠?qū)е罗r(nóng)田土壤氮素?fù)p失，降低土壤肥力，促進(jìn)溫室氣體N2O排放。但是從生態(tài)學(xué)的角度考慮，反硝化作用能夠把生態(tài)系統(tǒng)固定的氮和人為活化氮以N2的形態(tài)返回到大氣氮庫中，是活性氮最終以惰性氮離開土壤、水體等內(nèi)部生物循環(huán)而回到大氣的唯一自然途徑[1]。因此，反硝化過程能夠去除水體中的硝態(tài)氮，調(diào)節(jié)水體質(zhì)量，平衡生物固氮輸入通量，減少活性氮對(duì)環(huán)境和氣候變化的影響。雖然有關(guān)反硝化的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但是迄今為止仍然沒有一種合適的方法來量化反硝化速率[2]，主要原因有：（1）大氣和水體中氮?dú)獾沫h(huán)境背景值很高，從而使得測定反硝化產(chǎn)生的微量氮?dú)獯嬖诤艽罄щy；（2）反硝化過程具有很大的時(shí)空變異性；（3）目前所采用的方法大都是改變了底物濃度，或者破壞了樣品的物理環(huán)境，從而不能獲得真實(shí)的反硝化速率；（4）不同研究者在反硝化測定方法上缺乏交流，從而阻礙了反硝化的研究進(jìn)展。因此，本文綜述了目前在陸地和水體生態(tài)系統(tǒng)中幾種常用的測定反硝化速率的方法，并針對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行討論，以期為今后反硝化測定方法的進(jìn)一步研究提供參考。

1目前常用的反硝化測定方法

1.1乙炔抑制法

采用乙炔抑制法來研究反硝化是基于高濃度乙炔能夠抑制硝化作用以及N2O向N2的還原[3]，從而使得N2O成為反硝化的終產(chǎn)物。由于N2O在大氣中的濃度很低，因此很容易測得N2O的產(chǎn)生量，從而間接推算出反硝化速率。乙炔抑制法主要包括箱法和土柱方法。最早使用的乙炔抑制法是向原位箱下的土壤中灌注乙炔[4,5]，但是這種方法費(fèi)力，難于操作。基于這個(gè)缺點(diǎn)，研究者們開始采用土柱方法。土柱法包括動(dòng)態(tài)土柱法和靜態(tài)土柱法，所謂動(dòng)態(tài)土柱法是指使用通氣泵促使乙炔和土壤空氣在土壤大孔隙中循環(huán)，然后在2小時(shí)之內(nèi)連續(xù)測定N2O的濃度變化以計(jì)算反硝化速率[6]。但是由于氣體是采用強(qiáng)制泵入的方式，容易導(dǎo)致土柱中壓力的變化，進(jìn)而破壞土壤結(jié)構(gòu)、影響氣體擴(kuò)散。靜態(tài)土柱法則是把乙炔注入到一個(gè)密封的容器中，經(jīng)過一定時(shí)間均衡后測定N2O的積累速率[7]。與動(dòng)態(tài)土柱法相比，靜態(tài)土柱法不存在氣體循環(huán)過程，并可進(jìn)行大量樣品測定，但是乙炔擴(kuò)散進(jìn)入土柱以及N2O擴(kuò)散出土柱都有一定的限度[8]。用乙炔抑制法測定反硝化速率操作簡單便捷，成本低，可以進(jìn)行大批量樣品的同時(shí)測定。其主要不足之處是乙炔抑制了硝化作用，當(dāng)NO3-成為反硝化的限制因子時(shí)，將低估反硝化損失量[9]，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。此外還存在一些其它問題：（1）在粘土或者飽和沉積物中，乙炔擴(kuò)散速率很慢，對(duì)硝化作用抑制不完全[10]；（2）長期反復(fù)使用乙炔會(huì)導(dǎo)致反硝化微生物對(duì)乙炔的適應(yīng)，將乙炔作為一種碳源，消耗乙炔，從而導(dǎo)致濃度降低，抑制效果下降[11]；（3）在土壤碳含量較高而NO3-濃度較低時(shí)（<10μmolL-1）可能促進(jìn)N2O的還原而削弱乙炔的抑制效果[11,12]；（4）乙炔中的雜質(zhì)氣體（如丙酮）會(huì)影響反硝化過程[13]。最近還有研究表明，在有氧氣存在的情況下，高濃度乙炔（大于0.1kPa）會(huì)促進(jìn)反硝化產(chǎn)生的NO分解或者催化NO的氧化，從而低估反硝化速率[14]。雖然乙炔抑制法存在很多問題，但由于迄今為止還沒有一個(gè)令人十分滿意的測定反硝化的方法，所以這種方法仍被廣泛使用[2]。如目前對(duì)于反硝化潛勢和反硝化酶活性的測定，普遍采用的都是乙炔抑制法[13]。低濃度乙炔能夠抑制硝化作用，高濃度乙炔不僅能抑制硝化作用，還能抑制反硝化作用過程中N2O向N2的還原。因此，Kester等[15]通過向土壤中添加不同濃度的乙炔，量化了林地、草地、河水底泥中硝化作用和反硝化作用對(duì)N2O排放的貢獻(xiàn)。Ullah[16]采用乙炔抑制法研究了農(nóng)業(yè)流域內(nèi)不同利用類型土壤的反硝化能力及其影響因素，并估算了反硝化作用對(duì)流域內(nèi)硝態(tài)氮的去除能力。雖然這種方法可能低估了反硝化能力，但仍使人們認(rèn)識(shí)到了反硝化作用對(duì)于去除活性氮的重要作用。

1.215N同位素示蹤法

同位素示蹤法包括15N平衡差值法和15N示蹤氣體直接測量法。15N平衡差值法是基于微區(qū)試驗(yàn)中不存在徑流損失，氮的當(dāng)季淋洗損失又極低，而把所有的氮素?fù)p失都作為氣態(tài)損失的基礎(chǔ)上建立的。廖先苓等[17]把從15N微區(qū)試驗(yàn)中測得的氮素總損失量扣除氨揮發(fā)損失量后作為硝化-反硝化損失量，其優(yōu)點(diǎn)是15N的豐度和氨揮發(fā)量可準(zhǔn)確測定，其主要缺點(diǎn)是測定結(jié)果是硝化和反硝化的共同氣態(tài)損失，不能區(qū)分兩個(gè)過程對(duì)氮轉(zhuǎn)化的具體貢獻(xiàn)[18]。此外，李振高等認(rèn)為[19]微區(qū)施入的15N與土壤原有15N進(jìn)行交換，土壤中氣體逸出受阻使測定值偏低，再加上氮總損失量、氨揮發(fā)量等各個(gè)環(huán)節(jié)的測定，使得最終的測定誤差很大。15N示蹤氣體直接測量法是向土壤中添加15N標(biāo)記的NO3-，然后測定產(chǎn)生的N2和N2O的15N來量化土壤的反硝化速率[20]。這種方法出現(xiàn)于50年代末，80年代廣泛應(yīng)用于旱地，近年來才被用于測定稻田土壤和沉積物的反硝化損失。Petersen[21]向原狀沉積物柱樣中分別加入15NO3-和15NO2-，通過測定15N2的量，不僅計(jì)算出反硝化速率，而且還量化了厭氧銨氧化對(duì)N2排放量的貢獻(xiàn)，并指出沉積物中銨態(tài)氮硝化產(chǎn)生的NO3-是反硝化的主要氮源。雖然15N示蹤氣體直接測量法也存在氣體擴(kuò)散受阻、標(biāo)記不均勻等缺點(diǎn)，但因其具有較高的靈敏度使得此種方法仍然得到了廣泛應(yīng)用并推動(dòng)了反硝化過程的研究。使用15N同位素示蹤技術(shù)是建立在假定施入到土壤中的15N能夠和土壤本底15N快速均勻混合的基礎(chǔ)上。理論上講，由于土壤結(jié)構(gòu)不均一、存在擴(kuò)散障礙物、生物擾動(dòng)、同位素分餾等因素使得在靜態(tài)土柱中很難達(dá)到這種快速均勻混合的狀態(tài)。但Steingruber等認(rèn)為[22]，同位素的非均勻混合對(duì)反硝化測定結(jié)果的影響很小，所導(dǎo)致的誤差不超過10%。其他研究表明[23]，即使土壤中的NO3--N標(biāo)記是不均勻的，仍能對(duì)反硝化產(chǎn)生的N2作出準(zhǔn)確的估計(jì)，因?yàn)榉蔷鶆蚧旌纤鶎?dǎo)致的誤差可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差。值得注意的是，有報(bào)道指出土壤微生物傾向于利用輕質(zhì)同位素，從而使得該方法低估了反硝化的發(fā)生程度[19]。此外，向氮源缺乏的生態(tài)系統(tǒng)中添加15N標(biāo)記的NH4+、NO3-可能會(huì)增加可利用的氮源，從而高估反硝化速率，因此這種方法最好用在氮素含量較高的生態(tài)系統(tǒng)中[23]。

1.3N2直接量化法