硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法建立

　　【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法。方法 測定硝酸咪康唑搽劑對大腸埃希菌等5種試驗菌的回收率，對2個控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的檢查方法進行驗證。結果 用薄膜過濾法和0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑檢查本品的細菌總數、真菌及酵母菌計數，其試驗菌回收率均達到70%以上。同樣用該方法檢查本品的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，其試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應。結論 用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑可以消除硝酸咪康唑搽劑在試驗條件下的抑菌作用，從而順利檢出該品種所污染的各種微生物。

　　【關鍵詞】 硝酸咪康唑搽劑;微生物限度檢查;方法學驗證;醫學期刊投稿

　　Abstract:Objective To establish a method of microbial limit test for miconazole nitrate liniment. Methods Centrifugal sedimentation and culture medium diluted method were used to validate the accuracy and feasibility of microbial limit test.Results The recovery of bacteria, yeast and mould were above 70%. P. aeruginosa and S.aureus were positive and Gramnegative organisms were negative. Conclusions Membrane filtration and the polysorbate 80 sodium chloridepeptone buffer can be used to test the total viable aerobic count and specifiedorganisms (include S. aureus and P. aeruginosa) for miconazole nitrate liniment.

　　Key words:miconazole nitrate liniment;microbial limit test;method validation

　　微生物限度檢查法是檢查非規定制劑及原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項目包括細菌數、真菌數、酵母菌數及控制菌檢查[1]。但具有抑菌成分的藥品由于其抑菌活性的干擾，常規檢查結果不能真實地反映出藥品中污染微生物的情況，必須先消除供試品中的抑菌活性，再根據《中國藥典》規定的方法進行檢查，并必須對所采取的檢查方法進行驗證，以確認抑菌活性的消除和檢查方法的可靠性。具有抑菌作用的藥品，每個品種抑菌效果不同，因此適合各個品種的微生物限度檢查法也不同。

　　作者曾用常規法、培養基稀釋法及薄膜過濾法(用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗)對硝酸咪康唑搽劑進行微生物限度檢查，結果均不能達到藥典要求。吐溫80是親水性表面活性劑，具有增溶作用，因此本文選擇用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液做沖洗劑檢查該藥品的細菌、真菌、酵母菌數和控制菌，結果滿意，可為同類藥品的微生物限度檢查法提供科學依據。

　　1材料

　　1.1菌種大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003], 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 980011], 黑曲霉(Asperg illus niger)[CMCC(F) 98003]，由廣東生物研究所提供，菌種代數均為第3代。

　　1.2培養基及試劑pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、營養肉湯、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、虎紅培養基、膽鹽乳糖培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、二鹽酸二甲基對苯二胺試劑、PDP瓊脂培養基、三氯甲烷、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基和革蘭氏染色劑。

　　1.3樣品硝酸咪康唑搽劑，阿特維斯(佛山)制藥有限公司，批號：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亞砜。

　　2方法與結果

　　2.1菌液制備[1]

　　2.1.1取經37 ℃ 培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與大腸埃希菌的肉湯培養物1 mL，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數50～100 cfu的菌懸液，做活菌計數。

　　2.1.2取經25 ℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數50～100 cfu的菌懸液，做活菌計數。

　　2.1.3接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數50～100 cfu的孢子懸液，做活菌計數。

　　2.2供試液的制備[2]取本品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。

　　2.3驗證方法

　　2.3.1細菌、真菌和酵母菌計數法回收率的測定

　　薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑對各試驗菌的回收率進行實驗，3次獨立平行試驗結果的均值見表1[3]。

　　①試驗組：取供試液10 mL到薄膜過濾器中,用無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后1次沖洗液中加入1 mL的試驗菌液(50～100 cfu/mL)沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好的營養瓊脂培養基或虎紅培養基平板上，置30～35 ℃培養48 h或23～28 ℃培養72 h。記錄菌落數。試驗組的菌回收率=(試驗組平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)÷菌液組的平均菌落數×100%。

　　②菌液組[4]：在過濾器中預先加入大約20 mL的無菌0.9%氯化鈉溶液，再吸取1 mL的試驗菌液(50～100 cfu/mL)到過濾器中，過濾。再用100 mL無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次，取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好的營養瓊脂培養基或虎紅培養基平板上培養，培養方法同試驗組。

　　③供試品對照組：方法同試驗組，但不加試驗菌液。

　　④稀釋劑對照組：方法與試驗組同，其中供試液用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替。稀釋劑對照組的菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數÷菌液組的平均菌落數×100%

　　表1各試驗菌株的回收率　略

　　從表1可知，在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率、試驗組的菌回收率均不低于70%。可用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗方法檢查硝酸咪康唑搽劑的細菌、真菌及酵母菌數。

　　2.3.2控制菌檢查方法驗證

　　①試驗組：取供試液10 mL到薄膜過濾器中, 用無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗菌(驗證銅綠假單胞菌時,試驗菌為銅綠假單胞菌)，沖洗后取出濾膜放入預先制備好的相應培養基中，依相應控制菌檢查法檢查。

　　②陰性菌對照組：方法同試驗組，試驗菌改為50～100 cfu陰性對照菌(2個控制菌驗證的陰性對照菌均為大腸埃希菌)。

　　③菌液組 ：在過濾器中預先加入約20 mL的無菌0.9%氯化鈉溶液，在吸取50～100 cfu試驗菌到薄膜過濾器中，用100 mL 0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預先制備好營養瓊脂培養基上，置(36±1)℃培養48 h，記錄活菌數[5]。

　　3次平行試驗結果一致，試驗結果見表2。

　　表2對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的驗證結果　略

　　從表2可見，用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫pH7.080氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，方法成立。

　　3討 論

　　硝酸咪康唑搽劑為廣譜抗真菌藥，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亞砜等成分，對皮膚癬菌、念珠菌等有抗菌作用，對某些細菌也有一定抑制作用。《中國藥典》2005版規定，對藥品在微生物限度檢查時，其方法應通過驗證，以確認供試品的抑菌活性已被消除而保證檢查方法的可靠性。從本品的微生物限度檢查法的建立研究可見，選用薄膜過濾法聯用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液作沖洗劑來檢查本品的細菌數、真菌、酵母菌數及控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的方法有效，在細菌總數、真菌及酵母菌計數實驗中，試驗菌回收率均能達到70%以上;銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查實驗，試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應。本文結果可為同類產品的微生物限度檢查方法驗證提供科學的依據。

　　【參考文獻】

　　[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥：二部[S].北京：化學工業出版社，2005：附錄XIJ.

　　[2] 馬緒榮，蘇德模.抑菌性供試品的供試掖制備方法[J].藥品微生物學檢驗手冊,2001,2(2)：65.

　　[3] 王剛林，周劍.含抑制菌成分中成藥固體制劑微生物限度檢查驗證方法的建立[J].中華實用醫藥雜志,2006,6(2):26.

　　[4] 桑國衛.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：325.

　　[5] 林麗英，陳浩桉.大黃蟲蟅丸微生物限度檢查法的建立[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,17(7)：4.