鼻咽癌放療患者血清miR-196a表達(dá)的臨床意義

　　摘要：目的：MicroRNAs(miRNAs)屬于非編碼蛋白基因,是一類負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的小RNA,血清中miRNAs具有重要臨床意義。為探討miR-196a在NPC中表達(dá)的臨床意義,本研究分析血清miR-196a表達(dá)水平與NPC放療反應(yīng)的相關(guān)性。方法：收集選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2010年6月—2019年6月接受調(diào)強(qiáng)放療并有完整隨訪資料的NPC患者138例作為研究的實(shí)驗(yàn)組,同期選取來院健康檢查的正常人62例作為對照組。對照組采集空腹靜脈血,所有患者均于放療前采集空腹靜脈血,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測血清miR-196a表達(dá)水平;分析血清miR-196a高表達(dá)與NPC患者臨床分期及無病生存期(DFS)的相關(guān)性。以實(shí)體瘤變化和隨訪結(jié)果為評判標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)療效將患者分為A組(放療癌灶完全緩解)和B組(放療癌灶部分緩解+放療癌灶穩(wěn)定進(jìn)展);進(jìn)而分析血清miR-196a表達(dá)水平與NPC療效的關(guān)系。結(jié)果：138例NPC患者miR-196a在血清中高表達(dá)122例(88.41%);其中86例臨床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)81例,16例臨床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)14例,36例臨床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)27例;各組NPC血清miR-196a表達(dá)與正常對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。按放療效果分析,86例A組患者,血清miR-196a高表達(dá)71例(82.56%);52例B組患者,血清miR-196a高表達(dá)51例(98.08%),包括穩(wěn)定進(jìn)展19例(100.00%,19/19)和部分緩解32例(96.97%,32/33);A、B兩組血清miR-196a高表達(dá)比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。A組患者中位DFS(36個(gè)月)明顯高于B組患者中位DFS(10個(gè)月),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：血清miR-196a高表達(dá)提示臨床NPC放療預(yù)后不佳,該基因有望成為NPC預(yù)后的血清生物標(biāo)志物。

　　本文源自中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2020,26(04):405-409.《中國耳鼻咽喉顱底外科》雜志，于1995年經(jīng)國家新聞出版總署批準(zhǔn)正式創(chuàng)刊，CN:43-1241/R，本刊在國內(nèi)外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時(shí)效性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中主要欄目有：臨床報(bào)道、病案報(bào)道、綜述等。

　　鼻咽癌為我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一,具有明顯區(qū)域聚集性,在中國南部地區(qū)發(fā)病率較高[1]。我國NPC發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平[2]。NPC早期癥狀不明顯,且癌灶隱匿于鼻咽腔內(nèi),所以臨床NPC早期診斷有一定難度[3]。臨床NPC最后確診時(shí),約70%～80%已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。放射治療是臨床NPC首選的治療方法,放療能有效控制NPC病變。隨著調(diào)強(qiáng)放療的推進(jìn),NPC療效顯著,但放療后仍有30%出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)[5]。另一方面,NPC放療有較大的毒副反應(yīng)。因此,放療療效是NPC研究的一個(gè)重要方向。

　　MicroRNAs(miRNAs)是一種短的(20～24nt)單鏈小分子RNA,在多種腫瘤中表達(dá)異常,而患者液體活檢的血清miRNAs是一種潛在的生物標(biāo)志物[6]。目前miRNAs在腫瘤診治方面已取得了較大進(jìn)展,血清miRNAs可以應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)進(jìn)行分析。在qPCR中,目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,則熒光增加越快。本研究應(yīng)用相對定量qPCR的比較CT法評估基因表達(dá)水平。

　　MicroRNA-196a(miR-196a)是由兩個(gè)基因組位點(diǎn)HOXC(人類的Chr12,基因MIR196A2)和HOXB(人類的Chr17,基因MIR196A1)轉(zhuǎn)錄而來,分別位于HOX9的上游[7]。MiR-196a與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),發(fā)揮一種致癌基因的作用。本研究旨在探討miR-196a在NPC中表達(dá)的臨床意義,分析人NPC血清miR-196a的表達(dá)差異以及與NPC放療反應(yīng)的相關(guān)性。

　　1、資料與方法

　　1.1臨床資料

　　收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2010年6月—2019年6月接受調(diào)強(qiáng)放療(68.0～73.6Gy)NPC患者臨床資料,分析隨訪結(jié)果選取138例NPC患者作為研究的實(shí)驗(yàn)組,包括男86例,女52例;年齡35～73歲,中位發(fā)病年齡為49歲。根據(jù)AJCC(第八版)NPC臨床分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期36例,Ⅲ～Ⅳ期86例。138例均為非角化癌(未分化型)。另以來院健康體檢結(jié)果均正常者62例作為對照組,男37例,女25例;年齡38～71歲,中位年齡47歲。本研究經(jīng)患者及本院倫理委員會(huì)同意。

　　1.2治療方法及血液收集

　　本研究入選的NPC臨床資料和隨訪結(jié)果齊全,138例均為單純接受調(diào)強(qiáng)放療(68.0～73.6Gy/30～33次,2.1～2.3Gy/次)的NPC患者。對照組62例采集空腹靜脈血;實(shí)驗(yàn)組138例NPC患者均在放療前采集空腹靜脈血;采集后的靜脈血首先置于4℃,靜置2h;然后低溫離心機(jī)4℃低速離心10min(2000g)取上清液;所有血清均離心取上清后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.3血清總RNA提取

　　首先分取400μL血清,加600μL的Trizol,混勻后再靜置10min;再加200μL的氯仿,振蕩15s后靜置15min;低溫離心機(jī)4℃下12000轉(zhuǎn)離心25min后取上清;然后異丙醇與上清液以等體積輕輕混勻,并室溫靜置10min,4℃下12000轉(zhuǎn)離心15min,棄上清留沉淀;加1mL無酶水配制的75%乙醇,輕輕混合再4℃離心5min(7000轉(zhuǎn))棄上清留沉淀晾干,加入25μL無酶水溶解沉淀;以無酶水作空白對照測RNA濃度。

　　1.4總RNA逆轉(zhuǎn)錄

　　在冰上溶解提取的RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶把提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:反應(yīng)管分別加入1μg小分子RNA、PolyAPolymerase(2.5U/μL)1μL、1μL的RTaseMix、5μL的5×PAP/RTBuffer,用ddH2O(RNase/Dnasefree)補(bǔ)充至25μL,在37℃作用60min、85℃下5min滅活酶,即獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

　　1.5qPCR分析血清miR-196a表達(dá)

　　實(shí)驗(yàn)在冰上進(jìn)行:用雙蒸水稀釋miR-196a引物及隨機(jī)下游引物稀釋成2μΜ(U6的引物序列:CAAGGATGACACGCAAATTCG;hsa-miR-196a的引物序列TAGGTAGTTTCATGTTGTTGGG),設(shè)置U6為內(nèi)參基因,通用反向引物(Universalprimer)QIAGEN試劑盒自帶,引物試劑盒均由銳博公司提供;用雙蒸水將上述逆轉(zhuǎn)模板cDNA按1:3稀釋。在EP管中混合下列試劑:10μL的2×All-in-OneqPCRMix、2μL的All-in-OneTMmiRNAqPCRPrimer(2μM)、2μL的UniversalAdaptorPCRPrimer(2μM)、1:3稀釋模板cDNA、0.4μL的50×ROXReferenceDye,用3.6μL雙蒸水補(bǔ)充至20μL;短暫離心,加入96孔qPCR板內(nèi)離心:按表1設(shè)置qPCR反應(yīng)程序完成miR-196a的qPCR分析。

　　表1血清miR-196aqPCR反應(yīng)程序設(shè)置

　　1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　基因表達(dá)量的計(jì)算,采用2-CT法,計(jì)算出cutoff值。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì),以%表示所有計(jì)數(shù)資料,以χ2檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù);以(x±s)表示計(jì)量資料以t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2、結(jié)果

　　2.1NPC患者血清miR-196a的表達(dá)

　　本研究應(yīng)用相對定量qPCR的比較CT法評估基因表達(dá)水平,以比較CT法評估m(xù)iR-196a基因表達(dá)高低,直接從qPCR儀器獲取相對定量數(shù)據(jù)。qPCR顯示NPC患者血清miR-196a以高表達(dá)為主,而正常血清miR-196a以低表達(dá)為主。當(dāng)cutoff值為0.0813時(shí):138例NPC患者血清miR-196a高表達(dá)122例(88.41%);而對照組62例血清中,僅6例miR-196a高表達(dá)(9.68%);兩組miR-196a高表達(dá)相比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01);而兩組的性別、年齡相比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.01)。

　　2.2患者血清miR-196a高表達(dá)與NPC臨床分期的關(guān)系

　　138例NPC患者miR-196a在血清中高表達(dá)122例(88.41%);其中86例臨床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)81例,16例臨床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)14例,36例臨床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)27例;NPC患者各組血清miR-196a表達(dá)與正常對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。具體見表2、3。

　　表2NPC組各臨床分期與對照組的血清miR-196a表達(dá)情況比較(例)

　　2.3患者血清miR-196a高表達(dá)與NPC放療效果的關(guān)系

　　采用如上述qPCR的2-△△CT法標(biāo)準(zhǔn)分析NPC血清miR-196a表達(dá),當(dāng)cutoff值為0.0813時(shí),高于該值為miR-196a高表達(dá)。本研究qPCR顯示放療后癌灶穩(wěn)定進(jìn)展的NPC患者(19例)所有血清均高表達(dá)miR-196a,因此我們按放療效果進(jìn)行了miR-196a的表達(dá)分析。臨床上NPC放療后癌灶完全緩解(A組),提示放療效果相對較好;NPC放療后癌灶穩(wěn)定進(jìn)展患者,臨床提示其放療效果相對較差(B組);NPC放療后癌灶部分緩解患者,提示其療效介于兩者之間,但放療后癌灶部分緩解可能有癌細(xì)胞殘存,所以這些NPC歸于B組。MRI顯示A組完全緩解NPC患者腫塊對放療敏感,患者放療前后腫塊變化顯著(圖1a、b),而B組放療穩(wěn)定進(jìn)展NPC患者M(jìn)RI顯示整塊繼續(xù)增大(圖1c、d);另一方面,血清樣本qPCR的溶解曲線為一個(gè)單一的吸收峰(圖2a)且擴(kuò)增曲線較好(圖2b),提示該基因血清中穩(wěn)定易于檢測;miR-196a高表達(dá)提前進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期、如箭頭所指上升曲線居前(圖2b)。

　　根據(jù)NPC放療效果分析血清miR-196a高表達(dá)結(jié)果:A組完全緩解NPC的86例,71例患者血清miR-196a高表達(dá)(71/86,82.56%);B組19例穩(wěn)定進(jìn)展NPC患者均為miR-196a高表達(dá)(19/19,100.00%),以及B組33例部分緩解NPC患者高表達(dá)32例(32/33,96.97%),B組高表達(dá)共為51例(51/52,98.08%);兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.614,P<0.01)。完全緩解NPC患者中位DFS(36個(gè)月)明顯高于放療穩(wěn)定進(jìn)展NPC患者中位DFS(10個(gè)月)(P<0.01)。

　　表3NPC組各臨床分期的血清miR-196a表達(dá)情況比較[例(%)]

　　圖1影像學(xué)MRI檢測NPC患者放療前后腫塊變化,A組患者放療前NPC(a)紅色線圈內(nèi)所示NPC腫塊(Ⅳ),放療12個(gè)月后復(fù)查(b)NPC腫塊完全緩解;B組患者放療前NPC(c)紅色線圈內(nèi)所示為NPC腫塊,放療12個(gè)月后復(fù)查(d)紅色線圈內(nèi)NPC繼續(xù)增大腫塊

　　圖2NPC血清一組樣本qPCR分析miR-196a表達(dá)的代表性結(jié)果

　　3、討論

　　非編碼微小RNA(microRNAs,miRNAs)是內(nèi)源性的RNA分子,具有抑癌基因或癌基因的雙重作用,為18～25個(gè)核苷酸組成單鏈的RNAs,在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[8]。非編碼miRNA可以靶向特定的編碼mRNA形成相對完整的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),可導(dǎo)致靶向的mRNA被降解而負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯過程[8,9,10]。不同種類的腫瘤具有不同的miRNAs表達(dá)譜,miRNAs表達(dá)譜與腫瘤特性相關(guān)。檢測miRNAs表達(dá)水平,可用于腫瘤療效評估和預(yù)后判斷,可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物[8,9,10]。

　　有研究顯示miR-196a在多種腫瘤中有癌基因的特性,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。MiR-196被報(bào)道在各種惡性腫瘤中異常表達(dá),包括黑素瘤[9]和食管癌[10]。研究者認(rèn)為是消化道腫瘤的生物標(biāo)志物[11]。本研究顯示miR-196a在正常人血清中低表達(dá),而在NPC血清中高表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。研究也表明低氧誘導(dǎo)的miR-196下調(diào)可促進(jìn)肝癌發(fā)生及促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[12];miR-196a通過靶向IκBα促進(jìn)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌[13]。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血清miR-196a高表達(dá)與NPC臨床分期相關(guān),晚期NPC患者血清miR-196a高表達(dá)(94.19%)。這些結(jié)果提示miR-196a在NPC中同樣有癌基因特性,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-196a的惡性特征。

　　目前血清miR-196a表達(dá)是否能影響NPC放療反應(yīng)尚未見報(bào)道。Bao等[14]研究顯示血清miR-196a為非小細(xì)胞肺癌的無創(chuàng)檢測生物標(biāo)志物。本研究分析顯示miR-196a高表達(dá)與放療效果有關(guān),qPCR顯示放療后癌灶穩(wěn)定進(jìn)展的NPC患者所有血清均高表達(dá)miR-196a,而MRI顯示放療穩(wěn)定進(jìn)展NPC患者整塊繼續(xù)增大(從圖1c放療前,變成圖1d放療后);而血清miR-196a分析顯示放療穩(wěn)定進(jìn)展NPC患者該基因高表達(dá)(圖2b),因此提示NPC患者血清中miR-196a高表達(dá),可能影響NPC放療效果,放療前血清miR-196a高表達(dá)是NPC患者放療的不利因素,但血清miR-196a參與NPC放療反應(yīng)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚,而且其調(diào)控的靶基因亦待深入研究。

　　在本研究中,我們對NPC血清中miR-196a表達(dá)進(jìn)行了初步分析,初步結(jié)果提示miR-196a高表達(dá)可能是NPC無創(chuàng)檢測的一個(gè)血清特征分子,放療前NPC患者血清miR-196a高表達(dá)為NPC放療不利因素,提示NPC血清中miR-196a高表達(dá)者可能預(yù)后不佳。