中國(guó)東海微型鞭毛蟲(chóng)群落的分布特征及其環(huán)境影響因子

　　摘要：海洋微型鞭毛蟲(chóng) (Microbial flagellates) 是海洋原生生物中一類高度異質(zhì)化的類群，物種多樣性高，具有多種營(yíng)養(yǎng)方式，在全球海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)廣闊的生態(tài)位，在生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 然而關(guān)于其生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)十分有限，特別是有關(guān)環(huán)境因子與其生物地理分布關(guān)系的研究更為罕見(jiàn)。 為了探究微型鞭毛蟲(chóng)群落多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及影響其生物地理分布格局的環(huán)境因素，本研究將高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)的顯微鏡觀測(cè)方法相結(jié)合，全面調(diào)查了中國(guó)東海春季和秋季微型鞭毛蟲(chóng)的群落特征，并深入探討了與環(huán)境因子之間的關(guān)系。 結(jié)果表明：東海微型鞭毛蟲(chóng)的豐度平均為 2.27×103個(gè)/ mL，表現(xiàn)為近岸處較高、隨離岸距離的增加而下降的趨勢(shì);Shannon 多樣性指數(shù)呈現(xiàn)表層低于底層、近岸區(qū)低于陸架區(qū)的特征，反映了生物群落的穩(wěn)定程度以及對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)程度;不同類群的鞭毛蟲(chóng)具有各自獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)模式和相對(duì)固定的粒級(jí)，表現(xiàn)出對(duì)溫度、鹽度、溶解氧等環(huán)境因素的不同響應(yīng)，從而使群落的物種組成和分布模式呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化和生境差異。 研究結(jié)果可為深入認(rèn)識(shí)東海海洋微型鞭毛蟲(chóng)的群落結(jié)構(gòu)、分布格局以及環(huán)境影響因素提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：微型鞭毛蟲(chóng);高通量測(cè)序;群落結(jié)構(gòu);環(huán)境因子;東海

　　郭馨; 黃成; 林曉晴; 鄭欣怡; 劉強(qiáng); 黃凌風(fēng)， 生態(tài)學(xué)報(bào) 發(fā)表時(shí)間：2021-11-26

　　正如海洋中的經(jīng)典食物鏈一樣，海洋微型生物食物網(wǎng)在維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能中同樣起到重要作用[1?2]。 其中，粒徑小于 20 μm 的微型鞭毛蟲(chóng)(Microbial flagellates)以其龐大的多樣性、多樣的營(yíng)養(yǎng)模式和快速的生長(zhǎng)代謝率，成為微食物網(wǎng)中非常重要的一環(huán)，在全球海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)廣闊的生態(tài)位，在生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是海洋生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)[3?4]。 鞭毛蟲(chóng)不是分類學(xué)上的定義，而是包括具有相似生態(tài)學(xué)特征———具有一條或多條鞭毛，利用鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)或攝食活動(dòng)的單細(xì)胞原生生物的群體總和[3， 5]。近年來(lái)，飛速發(fā)展和不斷更替的分子生物學(xué)技術(shù)揭示了海洋微型鞭毛蟲(chóng)不可思議的龐大的多樣性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)方法(如分離培養(yǎng)和顯微鏡鑒定)所認(rèn)知的數(shù)量[6]。 然而，大多研究并沒(méi)有將鞭毛蟲(chóng)這一大類群?jiǎn)为?dú)從原生生物或者微型真核生物中提取出來(lái)，而是將其與其他類群如纖毛蟲(chóng)等作為一個(gè)整體群落進(jìn)行分析[7]。 研究表明，大部分纖毛蟲(chóng)種類的粒徑大于 20 μm，只有少數(shù)種類的粒徑在 20 μm 以內(nèi)，是微型鞭毛蟲(chóng)的主要捕食者[1]，在生態(tài)功能上與鞭毛蟲(chóng)類群有著一定的區(qū)別。 因此，將鞭毛蟲(chóng)類群與原生生物其他類群區(qū)分開(kāi)來(lái)進(jìn)行分析是非常有必要的。 目前，對(duì)海洋鞭毛蟲(chóng)群落的研究已逐漸從有關(guān)其形態(tài)特征(具有鞭毛)或者營(yíng)養(yǎng)模式(自養(yǎng)、異養(yǎng)和兼養(yǎng))等結(jié)構(gòu)和功能上的“同質(zhì)性”向其在系統(tǒng)進(jìn)化上的高度“異質(zhì)性”進(jìn)行轉(zhuǎn)變。 這種變化對(duì)于理解和認(rèn)識(shí)該類群生物在現(xiàn)代(和未來(lái))生態(tài)系統(tǒng)中獨(dú)特的生態(tài)地位、生態(tài)學(xué)過(guò)程、生物地理格局、在生態(tài)系統(tǒng)中的功能以及適應(yīng)自然海區(qū)環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制等具有至關(guān)重要的意義[6， 8]，有助于促進(jìn)對(duì)海洋鞭毛蟲(chóng)的生態(tài)學(xué)研究從現(xiàn)象和作用(是什么?)向過(guò)程與機(jī)制(為什么?)不斷深入。東海是一個(gè)具有傾斜地形特征、陸架開(kāi)闊的邊緣海[9]，受海陸分布以及冷、暖空氣交替的影響，具有明顯的季風(fēng)性氣候特征[10?11]。 同時(shí)，復(fù)雜的季節(jié)性變化的水團(tuán)運(yùn)動(dòng)影響著該海區(qū)的水文條件和生態(tài)環(huán)境[9， 11]，也影響了海洋微型鞭毛蟲(chóng)群落的分布格局。 但是到目前為止，針對(duì)該海區(qū)微型鞭毛蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的相關(guān)性研究仍不多見(jiàn)。 本研究采用高通量測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)的顯微鏡觀測(cè)方法調(diào)查了東海微型鞭毛蟲(chóng)的豐度、多樣性等群落特征，并分析了影響微型鞭毛蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，為揭示東海海洋微型鞭毛蟲(chóng)的群落結(jié)構(gòu)、分布格局以及環(huán)境影響因素提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 采樣時(shí)間和地點(diǎn)

　　本研究依托于國(guó)家自然科學(xué)基金委 2019 年春季(5 月)和秋季(9 月)的兩個(gè)“東海科學(xué)考察”共享調(diào)查航次，搭載“向陽(yáng)紅 18”科學(xué)考察船開(kāi)展了該海域環(huán)境因子和微型鞭毛蟲(chóng)群落的調(diào)查。 每個(gè)站位選擇表層(海面下 3 m)和底層(距海底 5—10 m)兩個(gè)水層進(jìn)行采樣。 兩個(gè)航次的調(diào)查站點(diǎn)見(jiàn)圖 1，使用 Surfer 20 作圖，注意春秋兩季相同名稱的采樣站點(diǎn)位置不一定相同。 為了分析的方便，根據(jù)地形將 50 m 等深線以內(nèi)海域定義為近岸區(qū)，50—200 m 等深線之間的海域定義為陸架區(qū)。

　　1.2 環(huán)境因子的采集與測(cè)定

　　用 Niskin 采水器分別采集各層海水。 溫度(Temperature， Temp)、鹽度( Salinity， Sal)、溶解氧(Dissolvedoxygen， DO)數(shù)據(jù)用船載 CTD(SBE917plus， SeaBird Corp.， USA)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)得。 營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定包括硝態(tài)氮(NO3 ? N)、亞硝態(tài)氮(NO2 ?N)、氨氮(NH4 ?N)、活性磷酸鹽(PO4 ?P)和活性硅酸鹽(SiO3 ?Si)，各參數(shù)的檢測(cè)均依據(jù)國(guó)家《海洋調(diào)查規(guī)范—第 4 部分：海水化學(xué)要素調(diào)查》(GB / T12763.4—2007)方法進(jìn)行[12]。 葉綠素 a(Chlorophylla， Chl a)濃度的測(cè)定采用丙酮萃取熒光法[13]。 超微型浮游生物包括海洋異養(yǎng)細(xì)菌(Heterotrophic bacteria，HB)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria， Cyan)(包括聚球藻(Synechococcus， Syn)和原綠球藻(Prochlorococcus， Pro))和微微型真核生物(Pico?sized eukaryotes， pico?Euk)，其豐度采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定[14]，具體方法參考《海洋微型生物生態(tài)學(xué)》第 14 章《海洋微型生物流式圖像技術(shù)》的內(nèi)容[15]。 小型浮游動(dòng)物(Micro?zooplankon， micro? Zoo)(主要包括纖毛蟲(chóng)、腰鞭毛蟲(chóng)等)使用虹吸法進(jìn)行富集后[16] 用 FlowCam 流式影像儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)顯微鏡鏡檢方法測(cè)定其豐度，再通過(guò) VisualSpreadsheet 軟件對(duì)目標(biāo)生物顆級(jí)(粒徑 20—100 μm)進(jìn)行計(jì)數(shù)[17]。 以上生物因子的測(cè)定方法同時(shí)參考了《海洋調(diào)查規(guī)范—第 6 部分：海洋生物調(diào)查》(GB / T12763.6—2007)的內(nèi)容[12]。

　　1.3 微型鞭毛蟲(chóng)群落樣本的采集與處理

　　1.3.1 豐度樣本

　　微型鞭毛蟲(chóng)(Nanoflagellate， NF) 的豐度測(cè)定以及營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和粒級(jí)結(jié)構(gòu)的劃分方式參考了 Huang[13] 和Granda[18]等人的研究。 海水樣本經(jīng) 20 μm 篩絹預(yù)過(guò)濾之后，依次進(jìn)行固定、過(guò)濾、染色、制片等步驟。 玻片在熒光顯微鏡(Leica FW 4000)100 倍物鏡下鏡檢;在紫外激發(fā)光下，微型鞭毛蟲(chóng)的細(xì)胞核顯藍(lán)光，以此確定細(xì)胞的存在;之后轉(zhuǎn)到藍(lán)色激發(fā)光下，觀察細(xì)胞是否呈現(xiàn)紅色熒光，有紅色熒光的為含色素體微型鞭毛蟲(chóng)(Pigmented nanoflagellate， PNF)，包括自養(yǎng)型和兼養(yǎng)型微型鞭毛蟲(chóng)，沒(méi)有紅色熒光的則為異養(yǎng)微型鞭毛蟲(chóng)(Heterotrophic nanoflagellate， HNF);統(tǒng)計(jì) HNF 和 PNF 在三個(gè)粒級(jí)(2—5、5—10、10—20 μm)內(nèi)的個(gè)數(shù)。 微型鞭毛蟲(chóng)的豐度(個(gè)/ mL)= (每個(gè)視野 NF 數(shù)量平均值×黑膜有效過(guò)濾面積) / 每個(gè)視野的面積×過(guò)濾水樣體積)。微型鞭毛蟲(chóng)豐度的海區(qū)平面分布圖由 Ocean Data View(version 5.2.1)制作。

　　1.3.2 多樣性樣本

　　每個(gè)站位各水層采集 5 L 海水，先經(jīng) 20 μm 篩絹預(yù)過(guò)濾后，依次通過(guò)直徑為 47 mm 的 2 μm 和 0.8 μm 孔徑的聚碳酸酯核孔膜(Millipore Corp.， Germany)，得到 0.8—2 μm、2—20 μm 粒級(jí) 的微微型和微型浮游生物樣本。 于液氮中保存，回到實(shí)驗(yàn)室后于-20℃儲(chǔ)存。采用 Qiagen 公司的 PowerWater