南海珊瑚來源真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分離鑒定及其次級代謝產物研究

　　摘要：【目的】南海珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 次級代謝產物分離鑒定及抑菌活性篩選。【方法】利用稀釋涂布平板法分離珊瑚共附生真菌。采用單菌多代謝產物方法(One strain many compounds, OSMAC)對分離菌株進行化學多樣性篩選，并采用濾紙片擴散法對真菌發酵產物進行抑菌活性分析。通過 ITS 測序鑒定活性菌株 SCSIO 40435 的分類地位，運用多種色譜手段從其粗提物中分離純化單體化合物，并利用各種波譜手段(HRESIMS、1D 和 2D NMR、單晶 X-ray 衍射法等)確定化合物的結構。最后，采用微量肉湯稀釋法對單體化合物的抑菌活性進行評估。【結果】從南海珊瑚樣品中分離得到 19 株共附生真菌，結合化學多樣性和抑菌活性分析，篩選出一株產物豐富且具有多種抑菌活性的菌株 SCSIO 40435。利用 ITS 測序分析將其鑒定為曲霉屬真菌(Aspergillus sp.)，進一步從其發酵產物中分離鑒定了 4 個對三聯苯類化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、 terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 為一個對三聯苯同源二聚體類新化合物。此外，首次對化合物 4 的單晶結構進行了報道。【結論】本研究表明南海珊瑚中含有豐富的共附生真菌資源，且具有產生結構新穎的活性次級代謝產物的潛力，有望成為藥物發現和開發的重要來源。

　　關鍵詞：珊瑚共附生真菌;活性次級代謝產物;對三聯苯二聚體

　　葉偉霞; 趙夢冉; 王璐; 蔣曉東; 張文軍; 張長生; 田海妍， 微生物學報 發表時間：2021-11-25

　　南海海域遼闊，生物資源種類繁多，是我國最重要的海島和珊瑚礁、紅樹林、海草床等生態系統分布區，也是全球海域生物多樣性最高的地區之一[1]。珊瑚礁生態系統是由生物和非生物構建的復雜、獨特的生態系統，是海洋中的“熱帶雨林”。珊瑚礁生態系統除為種類繁多的動植物提供棲息場所外還共附生著豐富的微生物種群[2]。這些微生物長期處于極端的生境下(高壓、高鹽度、寡營養、低溫、黑暗等)，寄生或共生于宿主之中，從而與宿主之間產生特殊的交流方式[3-4]。這種相互關系往往使共附生微生物進化出獨特的代謝途徑和防御體制，具有產生新穎結構的活性物質的潛能[5-6]。近年來，研究人員逐漸把目光從珊瑚礁的生態學意義、珊瑚微生物群的特征等研究領域轉向珊瑚共附生真菌活性次級代謝產物的發掘上，并取得了巨大進展。目前，從珊瑚共附生真菌中獲得的活性物質種類多樣，Wang 等從珊瑚共附生真菌次級代謝產物中分離得到具有新穎結構的硫代甘油酸酯取代的骨架重排混元二萜類化合物 Alternarin A，該化合物有顯著的神經藥理活性[7]。Cao 等以二級 MS 為指導從珊瑚來源的真菌中分離得到 4 個新穎的 7 元環肽，并半合成了一系列環七肽衍生物，其合成衍生物顯示出中等強度的抗結核桿菌活性[8]。Cheng 等從珊瑚來源真菌中分離得到新穎的三元螺環橘霉素衍生物[9]。至今已從珊瑚來源真菌中分離得到萜類、聚酮、肽類、蒽醌類以及生物堿等多種結構類型天然產物，這些天然產物呈現出抗癲癇、抗病毒、抗結核、抗炎以及抗腫瘤等多種生物活性[10-13]，珊瑚來源真菌已經成為當前最具開發前景的天然產物新藥源之一。

　　近期，我們從南海來源珊瑚中篩選出 1 株產物豐富且具有多種抑菌活性的真菌 SCSIO 40435，結合 ITS 測序鑒定為曲霉屬真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435，進一步從其大米培養物中分離鑒定了 4 個對三聯苯類化合物(1-4, 圖 1)。結合 HRESIMS、1D 和 2D NMR、X-ray 單晶衍射等波譜數據，確定化合物 dicandidusin A(1)為新的對三聯苯同源二聚體，2-4 為已知化合物，分別為 candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)。本文報道曲霉屬真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分離篩選及其次級代謝產物的分離鑒定與活性評價。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 樣品來源

　　供試珊瑚由中國科學院南海海洋研究所蔣曉東博士采集于中國南海，樣品采集后立即放置于無菌塑料樣品袋中，保存于 4 °C，低溫運輸至實驗室后用于真菌的分離。

　　1.1.2 培養基

　　(1)菌株分離固體培養基

　　PDA 培養基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖水 24 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g。GPSA 培養基(g/L)：葡萄糖 10g，細菌學蛋白胨 1 g，可溶性淀粉 10 g，K2HPO4 10 g，MgSO4 1 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g，pH 7.0~7.4。甘油-酪素培養基(g/L)：甘油 10 g，酪蛋白胨 10 g，KNO3 2 g，NaCl 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4•7H2O 0.05 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，CaCO3 0.2 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g，pH 7.0~7.4。

　　(2)菌株發酵篩選培養基

　　PDB 培養基(g / L)：馬鈴薯葡萄糖水 24 g，海鹽 30 g。大米培養基：大米 10 g，海鹽 0.45 g，蒸餾水 15 mL。小米培養基：小米 10 g，海鹽 0.45 g，蒸餾水 15 mL。燕麥培養基：燕麥 10 g，海鹽 0.6 g，蒸餾水 20 mL。

　　(2)抑菌活性篩選培養基

　　LB 培養基(g/L)：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，調 pH 7.0。 MH 培養基(g/L)：水解酪蛋白胨肉湯 21 g。

　　1.1.3 指示菌種類

　　測試病原菌包括：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)，鮑曼不動桿菌( Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ) ， 耐 甲 氧 西 林 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)。

　　1.1.4 主要試劑和儀器

　　PCR 擴增儀(Thermo Fisher Scientific ABI Veriti 96 well 型，德國 Eppendorf 公司);多功能組合式搖床(HYG-C，太倉實驗設備廠);超導核磁共振儀(Bruker AVANCE 700M 型，德國 Bruker 公司);高分辨飛行時間質譜(Bruker maXis，德國 Bruker 公司);柱色譜硅膠(100~200 目，煙臺江友硅膠開發有限公司)，硅膠薄層板(HS-GF 254，煙臺江友硅膠開發有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國 Agilent 公司);半制備高效液相色譜儀(Hitachi Primaide，日本日立公司);色譜柱(Phenomenex ODS column 250 mm × 10.0 mm, 5 μm; Phenomenex, USA);培養箱(MJ01，湖北黃石恒豐醫療器械有限公司)。試劑：色譜純乙腈(安徽時聯公司);其它試劑均為國產分析純(廣州化學試劑廠)。

　　1.2 真菌的分離和純化

　　將采集到的樣品置于超凈臺中，用經 75%乙醇消毒的剪刀剪取珊瑚樣品約 10 g，置于裝有已滅菌人工海水的燒杯中，對其表面進行清洗，用已滅菌的攪拌機將樣品充分碾碎，得組織原液。隨后將原液稀釋至 10-1、10-2，用移液槍吸取 200 μL 加到分離培養基的平板上，用一次性涂布棒涂布均勻，吹干后置于 28 ?C 培養箱中倒置培養 7~30 d，每隔 3 d 左右觀察菌落生長狀態。所有長出的真菌菌落均接種于 PDA 平板上，并多次純化直至獲得純的菌株。

　　1.3 菌株發酵篩選及活性測試

　　將分離得到的真菌菌株接種至 PDB 液體培養基中(50 mL/250 mL)，28 °C，200 r/min 振蕩培養 2 d 作為發酵培養的種子液，將生長良好的種子液以 10%(V/V)的接種量接種至 3 種固體培養基中，靜置培養 30 d。收菌后以體積比(V/V)1:1 加入丁酮浸泡提取、旋干，提取物均分成兩份。一份用甲醇溶解，HPLC 進樣檢測;另一份提取物加 DMSO 配成 20 mg/mL 的溶液，并采用濾紙片擴散法[14]進行抑菌活性篩選。

　　1.4 真菌 SCSIO 40435 的菌種鑒定

　　1.4.1 真菌基因組 DNA 提取及 ITS 基因序列擴增

　　利用真菌基因組 DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組 DNA，以通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對菌株 ITS 區域進行擴增。PCR 擴增體系為 20 μL：dd H2O 13 μL，DNA 模板 0.5 μL，dNTPs 1.2 μL，5 × FastPfu 緩沖液 4 μL，FastPfu 酶 0.4 μL，ITS1 引物 0.5 μL，ITS4 引物 0.5 μL。PCR 程序為：95 °C 5 min;95 °C 40 s，55 °C 35 s，72 °C 1 min，30 個循環;72 °C 10 min。PCR 產物由廣州擎科生物技術有限公司回收純化，完成測序。

　　1.4.2 系統發育分析

　　利用軟件 SeqMan 將測序得到的序列結果進行校對拼接，將拼接得到的完整序列在 NCBI 數據庫中進行 BLAST 比對，選擇同源性較高且具有代表性的真菌作為參考序列，下載相應菌株的序列和信息。使用軟件 MEGA-X 以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對菌株進行系統發育分析[15 -17]。

　　1.5 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 大規模固體發酵與萃取

　　將菌株 Aspergillus sp. SCSIO 40435 接種至 PDB 液體培養基中(50 mL/250 mL)，28 °C， 200 r/min 振蕩培養 2 d 作為放大發酵培養的種子液，將生長良好的種子液以 20%(V/V)的接種量接種至 15 kg 大米固體培養基中，靜置培養 30 d。收集菌體以體積比(V/V)1:2 加入丙酮浸泡提取 3 次，減壓濃縮回收丙酮。將 3 次濃縮浸膏合并，水混旋，乙酸乙酯萃取 3 次，經減壓濃縮后獲得 118 g 粗浸膏。

　　1.6 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中活性次級代謝產物的提取分離

　　乙酸乙酯萃取部位(118 g)，經硅膠柱色譜梯度洗脫(氯仿-甲醇：100/0, 95/5, 90/10, 85/15, 70/30, 50/50, 0/100)，通過薄層色譜法(TLC)檢識，結合 HPLC 分析檢測合并得餾分 Fr. 1 ~ Fr. 4。其中 Fr. 1 經硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(100/0, 5/1, 4/1, 7/3, 6/4, 5/5, 3/7, 2/8, 0/100)以及乙酸乙酯/甲醇(100/0, 7/3, 5/5, 3/7, 0/100)梯度洗脫，經 TLC 及 HPLC 分析合并得 11 個子餾分 Fr.1-A ~ Fr. 1-K，其中 Fr.1-F 經反相中壓色譜(ODS)，采用乙腈/水體系(A 相： 0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脫(VB : VA = 5 : 95~95 : 5，流速 10 mL/min)得到 20 個餾分 Fr. 1-F-01– Fr. 1-F-20。Fr.1-F-08 經凝膠色譜(Sephadex LH-20)，采用氯仿/ 甲醇(1:1)體系得到 4 個餾分 Fr.1-F-08-L1 – Fr.1-F-08-L4，其中 Fr.1-F-08-L4 經半制備液相，以乙腈/水體系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脫(0~15 min, 50% B 相;15~25 min, 50%~70% B 相; 25.1~33 min, 100% B 相)得到化合物 1(2.9 mg)和化合物 2(46.1 mg)。Fr.1-F-08-L3 經半制備液相，以乙腈/水體系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)等度洗脫(VB : VA = 50 : 50)得到化合物 3(25.2 mg)。將餾分 Fr.1-D 通過重結晶法，純化得到化合物 4(41.0 mg)。化合物 1-4 結構如圖 1。

　　1.7 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中次級代謝產物的活性評價

　　采用微量肉湯稀釋法[18]測定化合物 1-4 的最小抑菌濃度(MIC)。將化合物以 DMSO 為溶劑配成終濃度為 2.56 mg/mL 的母液，-20 °C 保藏備用。在 96 孔板上第 1 列的每孔加入 MH 液體培養基 200 μL，第 2 列的每孔加入 MH 液體培養基 100 μL，第 3 列加入 190 μL MH 液體培養基，其余每列加入 MH 液體培養基 100 μL。然后在第 3 列每孔加入樣品母液 10 μL，吹吸混勻，再從第 3 列吸取 100 μL 液體到第 4 列，吹吸混勻，同理依次往下 2 倍稀釋到第 12 列，最后 1 列取 100 μL 棄去。按照同樣的方法分別加入 DMSO 和環丙沙星作為對照組。

　　用無菌的 MH 液體培養基將培養好的菌液稀釋 1000 倍，除第 1 列外每孔加入稀釋菌液 100 μL，使化合物的終濃度分別為 64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/mL。以上實驗每組做 3 個平行，37 ℃培養。16 h 后觀察菌株生長情況，按照 CLSI 中“甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法”的終點判斷，與陽性生長對照管比較，抑制 80%細菌生長管藥物濃度為受試菌 MIC。

　　2 結果和分析

　　2.1 菌株的分離鑒定與篩選

　　對分離獲得的 19 株真菌分別采用 3 種不同的固體培養基(大米、小米及燕麥培養基)培養，通過 HPLC-DAD 檢測樣品的化學多樣性，通過紙片法篩選抑菌活性，發現菌株 SCSIO 40435 的次級代謝產物豐富(圖 2)，且對 4 種革蘭氏陽性菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)均具有抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑菌作用較強(表 1)。將菌株 SCSIO 40435 的 ITS 測序結果在 NCBI 數據庫中進行 BLAST 比對，并下載同源性較高的序列構建進化樹分析(圖 3)，發現菌株 SCSIO 40435 的 ITS 序列與 Aspergillus candidus(MT524443.1)的相似性最高，以 100%可信度聚在一個分支。綜合以上分析結果，將菌株鑒定為 Aspergillus sp. SCSIO 40435。

　　2.2 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物結構鑒定

　　通過大米固體培養基對真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 進行放大發酵，從中分離得到 4 個對三聯苯類化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 為對三聯苯同源二聚體新化合物。

　　2.2.1 新化合物結構解析

　　化合物 1 為灰褐色無定形固體，正離子高分辨電噴霧質譜(HRESIMS)顯示其準分子離子峰為 m/z 703.1786 [M + H]+(C40H31O12 計算值為 703.1810)，不飽和度為 26。分析化合物 1 的 1H、13C NMR 以及 HSQC 數據(表 2，圖 S1)發現有 2 個氧甲基、6 個 sp2 雜化的次甲基、12 個季碳和 3 個活潑質子信號，僅為元素組成信號的一半，提示化合物 1 可能是同源二聚體。對其核磁數據進一步分析發現化合物 1 的核磁數據與已知化合物 Candidusin A(2)的核磁數據高度相似，不同之處在于化合物 1 比 2 少了一個 sp2 雜化的次甲基(δH 6.76, H-17; δC 114.8, C-17)，推測 1 通過 C-17/C-17′相連。由于 1 中三個活潑質子信號位于同一處，因此無法利用 HMBC 相關(圖 S1)判斷二聚體的連接位置。分析 1 的 NOESY 相關，發現 H-5、H-14 與 H3-20 有相關(圖 4-A，圖 S1)，表明化合物 1 中兩個 sp2 雜化的次甲基分別位于 C-14(δH, 7.29; δC, 102.4)及 C-5 位(δH, 6.63; δC, 105.1)，進而證實化合物 1 的 2 個單體通過 C-17/C-17′相連，進一步詳細地歸屬 1 的核磁信號確證了平面結構。化合物 1 的 D 環與 D′環之間的聯苯鍵可能具有軸手性，對化合物 1 的旋光值進行測定，發現其旋光值近乎為零(-0.0007°)，[α]D 25 -2 (c 0.025, MeOH)，推測其為外消旋體。鑒于化合物 1 的含量較少，未對其進行手性拆分。最后，我們推測了化合物 1 的生物合成機理(圖 4-B)：化合物 1 的生物合成起源于酪氨酸，在生物體內酪氨酸經轉氨酶的作用轉化為 4-羥基苯丙酮酸，兩個 4- 羥基苯丙酮酸縮合，生成對三聯苯前體，經烯醇互變、還原、脫水等形成對三聯苯單體化合物 2 [19]，化合物 2 可能在 P450 氧化酶的催化下形成自由基化合物 2a，兩個 2a 發生自由基偶合、烯醇互變形成化合物 1 [20]。已報道的 P450 氧化酚羥基引發的自由基偶合反應多數發于分子內、形成分子內的 C-C 鍵，分子間的、能形成具有軸手性的聯苯鍵自由基偶合反應也有報道，但相對較少[20]。

　　2.2.2 已知化合結構鑒定

　　Candidusin A(2):灰褐色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 353.1028 (C20H17O6 計算值 353.1020)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.37 (3H, s, 10-OH/15-OH/16-OH), 7.42 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-8/12), 7.38 (1H, s, H-14), 7.08 (1H, s, H-17), 6.86 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-9/11), 6.70 (1H, s, H-5), 3.97 (3H, s, 20-OCH3), 3.75 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.1 (C-10), 149.9 (C-18), 149.8 (C-4), 148.9 (C-2), 146.3 (C-16), 143.0 (C-15), 136.4 (C-1), 131.0 (C-6), 130.8 (C-8/C-12), 129.1 (C-7), 115.6 (C-9/C-11), 114.5 (C-3), 114.1 (C-14), 107.5 (C-5), 106.0 (C-13), 99.0 (C-17), 61.0 (C-20), 56.3 (C-19)。波譜數據與文獻[21]報道基本一致。 Terphenyllin(3):白色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 339.1226 (C20H19O5計算值 339.1227)。 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.58 (1H, s, 10-OH), 9.34 (1H, s, 16-OH), 8.51 (1H, s, 2-OH), 7.44 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-8/12), 7.10 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-14/18), 6.85 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-9/11), 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-15/17), 6.39 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.29 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.2 (C-16), 156.3 (C-10), 153.5 (C-4), 148.6 (C-2), 139.7 (C-1), 132.8 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 130.2 (C-8/C-12), 129.2 (C-7), 125.0 (C-13), 117.3 (C-3), 115.6 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.4 (C-5), 60.5 (C-20), 56.0 (C-19)。波譜數據與文獻[22]報道基本一致。

　　4"-deoxyterphenyllin(4): 白色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 323.1285 (C20H18O4 計算值 323.1278)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.33 (1H, s, 16-OH), 8.61 (1H, s, 2-OH), 7.62 (2H, dt, J = 7.0, 1.3 Hz, H-8/12), 7.47 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-9/11), 7.38 (H, tt, J = 7.4, 1.2 Hz, H-10), 7.12 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-14/18), 6.78 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-15/17), 6.45 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.30 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 156.5(C-16), 153.6 (C-4), 148.7 (C-2), 139.9 (C-10), 138.7 (C-1), 132.9 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 129.1 (C-8/C-12), 127.7 (C-7), 124.9 (C-13), 118.2 (C-3), 128.8 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.7 (C-5), 60.8 (C-20), 56.1 (C-19)。波譜數據與文獻[21]報道基本一致。 Crystal data of 4"-deoxyterphenyllin(4):三斜晶系，空間群 P-1 (no. 2)，晶體大小為 0.01 mm × 0.01 mm × 0.01 mm;晶胞參數：a = 8.9333 (7) Å, b = 9.8055 (8) Å, c = 10.2676 (10) Å, α = 85.119 (7)°, β = 65.971 (9)°, γ = 72.469 (7)°, 晶胞體積 V = 782.57 (13) Å3, Z = 2, 計算密度 1.368 g/cm3，Cu-Kα 輻射( λ = 1.54184 Å );收集總衍射點 7224，獨立衍射點 3050;R1 = 0.0466，wR2 = 0.1487。該晶體數據已上傳至劍橋晶體學數據庫(CCDC - 2116133)。

　　2.3 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物抑菌活性實驗

　　采用微量肉湯稀釋法[18]評估了化合物 1-4 對 2 株革蘭氏陰性致病菌(大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606))和 4 株革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01))的抑菌活性。結果表明(表 3)化合物 1 對 6 株致病菌無明顯抑制活性，MIC 均大于 64 μg/mL。化合物 2 和 3 對革蘭氏陰性的大腸桿菌具有顯著生長抑制活性，MIC 分別為 1 μg/mL 和 0.5 μg/mL，其中化合物 2 對鮑曼不動桿菌有生長抑制活性，MIC 為 64 μg/mL。此外，化合物 2 對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也表現出中等強度生長抑制活性， MIC 分別為 32 μg/mL 和 16 μg/mL;但其對枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌無明顯抑制作用， MIC 大于 64 μg/mL。不同的是，化合物 4 對枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌則表現出一定的抑制作用，其 MIC 分別為 64 μg/mL 和 32 μg/mL，而對其它 4 株指示菌無明顯生長抑制活性， MIC 大于 64 μg/mL。

　　3 討論

　　珊瑚等海洋無脊椎動物是海洋生態系統的重要組成部分，蘊含著大量的共附生微生物資源。曲霉屬真菌不僅是海洋常見真菌種屬之一，也是活性次級代謝產物主要產生菌[23]。迄今為止，從海洋來源曲霉屬真菌中已發現多種結構類型的次級代謝產物，如生物堿[24]、聚酮[25]、萜類[26]、蒽醌類[27]、異香豆素類[28]、肽類[29]和對三聯苯類[30]等。Terphenyllin 是最先發現的對三聯苯類化合物，由 C Takahashi 等[31]在 1976 年分離于 Aspergillus candidus。此外，2016 年 Lars Andernach 等[32]從菌株 Allantophomopsis lycopodina 中分離獲得對三聯苯與萘并呋喃三聯苯的二聚體 allantonaphthofuran A-C。至今，已報道的對三聯苯衍生物已超過 230 個[33]，但對三聯苯類化合物二聚體鮮有報道。對三聯苯類衍生物具有多種生物活性，如神經氨酸酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制、抗氧化、細胞毒性、抗菌和免疫抑制活性[33-34]。本文對化合物 1-4 的抑菌活性進行了評估，發現已知化合物 2 不僅對革蘭氏陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用(16 μg/mL)微強于金黃色葡萄球菌(32 μg/mL)，還對革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有較強的抑制作用，MIC 達到 1 μg/mL。此外，對鮑曼不動桿菌也表現出微弱的抑制活性(64 μg/mL)，為潛在的抗菌藥物先導化合物。遺憾的是，其同源二聚體化合物 1 并沒有觀察到明顯的抑菌活性。

　　綜上所述，本研究通過化學多樣性與抗菌活性分析，從南海珊瑚中篩選了一株真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435進行次級代謝產物分離，從中鑒定了4個對三聯苯類化合物(1-4)，其中化合物 dicandidusin A(1)為首次報道的新穎對三聯苯化合物同源二聚體。本研究還對 4 個單體化合物進行了抗菌活性評估，結果顯示已知化合物 2 的抑菌活性明顯強于化合物 3 和 4，推測化合物 2 中形成的呋喃環單元可能對抑菌活性發揮重要作用。但其同源二聚體化合物 1 無明顯抑菌活性，因此，關于其具體活性作用機理的研究，還有待進一步探索。本研究不僅豐富了現有對三聯苯類化合物的多樣性，而且為后續利用珊瑚來源的真菌生產活性代謝產物奠定了基礎。