弓形蟲蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進展

　　要：弓形蟲是一種復(fù)雜的單細胞原生動物寄生蟲，通過入侵宿主細胞、分裂和誘導(dǎo)宿主細胞破裂等一系列的過程，在溫血動物體內(nèi)進行增殖。弓形蟲的生物學(xué)特征受基因組、表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄等多種因素的調(diào)控。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(proteinpost-translationalmodifications，PTMs)，如磷酸化、泛素化、巴豆酰化、棕櫚酰化、琥珀酰化、乙酰化、甲基化、糖基化和二羥基異丁酰化等，是弓形蟲調(diào)節(jié)對細胞外刺激的反應(yīng)和生命周期轉(zhuǎn)變的主要機制之一。弓形蟲蛋白質(zhì)翻譯后修飾通過改變靶蛋白的定位、結(jié)構(gòu)、活性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等增加蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和多樣性，從而在蟲體生命周期的任何時間點都可以發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在這篇綜述中，作者重點對弓形蟲蛋白質(zhì)翻譯后修飾進行簡要總結(jié)，以期為深入研究弓形蟲的生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：弓形蟲;頂復(fù)門寄生蟲;蛋白質(zhì)翻譯后修飾;表觀遺傳學(xué)

　　尹德琦; 魏子巍; 張義偉; 桑曉宇; 楊娜; 馮穎; 陳冉; 姜寧， 畜牧獸醫(yī)學(xué)報 發(fā)表時間：2021-11-23

　　弓形蟲是一種專一性的頂復(fù)門胞內(nèi)寄生蟲，被認為是世界上分布最廣泛的人畜共患病之一[1-2]。剛地弓形蟲的生命周期很復(fù)雜，主要以兩種感染形式存在：包括快速復(fù)制的速殖子和緩慢分裂的緩殖子。盡管弓形蟲通常會導(dǎo)致成年人和免疫力正常的人產(chǎn)生輕度癥狀，但對母體中發(fā)育的胎兒和免疫功能 低 下 的 人 造 成 嚴 重 的 危 害，甚 至 可 能 危 及 生命[3-4]。此外，弓形蟲病能夠引起家畜流產(chǎn)，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟效益。在日常生活中，人和溫血動物通常會因受到包囊或卵囊污染的食物或水而感染。目前，治療弓形蟲的有效藥物僅限于少數(shù)代謝抑制劑，包括乙胺嘧啶、磺胺類藥物、螺旋霉素和克林霉素等[5]。這些藥物具有一定的局限性和細胞毒性，因此尋找新的且有效的藥物靶標(biāo)迫在眉睫。

　　PTMs通過將共價修飾連接到多肽鏈上，擴展了20種蛋白質(zhì)氨基酸的化學(xué)組成和信息含量，增加了蛋白質(zhì)的功能性。大多數(shù)的 PTMs會在多肽鏈合成(翻譯)后進行連接，因此通常稱為“翻譯后修飾”(PTMs)[6]。PTMs是將一些化學(xué)基團共價偶聯(lián)到蛋白質(zhì)特定氨基酸上的過程，包括磷酸化、糖基化、泛素化、琥珀酰化、甲基化、乙酰化、巴豆酰化和二羥基異丁酰化修飾等[7-9]。PTMs(例如甲基化、乙酰化、SUMO 酰化和琥珀酰化等)及它們之間的相互作用能夠參與宿主先天免疫和炎癥的調(diào)節(jié)過程，為傳染性和免疫性疾病的發(fā)病機制以及潛在治療途徑提 供 理 論 基 礎(chǔ)[10]。迄 今 為 止，大 約 有 461種不同類型的 PTMs 已被 Uniprot數(shù)據(jù)庫所收錄(http：//www.uniprot.org/docs/ptmlist)，且在微生物、人、動物和植物等方面均發(fā)揮著重要功能[11]。PTMs可以在蛋白質(zhì)的生命周期中的任何時間發(fā)生，并且可以通過改變目標(biāo)蛋白質(zhì)活性、定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及其他功能等。即使同一種蛋白質(zhì)僅發(fā)生一種類型的修飾，也可能具有多種功能;如果同一蛋白質(zhì)上的相同 PTM 發(fā)生在不同的氨基酸上，則其功能也將不同;如果相同的蛋白質(zhì)發(fā)生不同的修飾類型，那么其功能和涉及的生物學(xué)過程更加復(fù)雜。因此，PTMs極大地增加了蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性。弓形蟲在不同的發(fā)育階段表達不同的數(shù)量的蛋白質(zhì)，但僅僅是數(shù)量的變化無法滿足其 復(fù) 雜 生 命 過 程 的 需 要，需 要 PTMs 的 參 與。PTMs能夠使蛋白質(zhì)的功能呈現(xiàn)指數(shù)增長，從而在 弓形蟲的生命活動中發(fā)揮著重要作用。棕櫚酰化、泛素化、磷酸化和甲基化等 PTMs會調(diào)控弓形蟲運動和入侵宿主細胞的過程，特別是磷酸化修飾通過調(diào)控蛋白激酶(proteinkinaseG，PKG)對其入侵和逸出宿主細胞起到信號樞紐的作用[7，12]。當(dāng)弓形蟲在細胞外環(huán)境中尋找宿主細胞入侵時，它會暴露于缺乏營養(yǎng)和氧化應(yīng)激的環(huán)境中，而 PTMs會在這種惡劣的環(huán)境中維持寄生蟲的生存能力[7，13]。此外，弓形蟲可通過乙酰化、磷酸化、糖基化、甲基化、小泛素化和泛素化等修飾對其組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)控，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程[7，14]。弓形蟲通過 PTMs下調(diào)免疫反應(yīng)和重組亞細胞結(jié)構(gòu)來操縱所入侵的宿主細胞，為蟲體生存、復(fù)制和入侵創(chuàng)造一個有利的條件[15]。總之，弓形蟲體內(nèi)普遍存在著乙酰化、磷酸化、巴豆酰化、琥珀酰化、二羥基異丁基酰化、泛素化、糖基化、丙二酰化等 PTMs 類型，這些 PTMs參與了蛋白質(zhì)加工與合成、表觀遺傳調(diào)控、毒力、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、入侵、運動以及應(yīng)激響應(yīng)等各種生物學(xué)過程。因此，PTMs可能是弓形蟲的發(fā)育過渡、生物學(xué)和發(fā)病機制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本綜述對弓形蟲的 PTMs進行簡要總結(jié)，旨在進一步全面解析弓形蟲的生物學(xué)特性和發(fā)病機制，為尋找新的抗弓形蟲藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

　　1 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究進展

　　1.1 泛素化修飾(ubiquitination)

　　泛素是一種由76個氨基酸組成的多肽，與蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基結(jié)合來調(diào)控細胞生物學(xué)過程。DeMonerri等[13]在弓形蟲中共鑒定到超過500多種蛋白質(zhì)上的1000個泛素化修飾位點，且大部分的泛素化蛋白與細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)。泛素化修飾需要E1 泛素激活酶、E2 泛素結(jié)合酶和 E3 泛素連接酶的共同調(diào)控[16-17]。泛素化修飾在弓形蟲細胞骨架、內(nèi)膜復(fù)合物以及滑動體(gliding-associatedprotein，GAP)等相關(guān)蛋白質(zhì)上也被檢測到，可能對于細胞骨架的重排具有重要的作用[13]。在弓形蟲染色質(zhì)修飾酶上 檢 測 到 泛 素 化 修 飾，包 括 乙 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶GCN5b(轉(zhuǎn)錄的主調(diào)節(jié)劑)以及與 GCN5b相互作用的蛋白質(zhì)[18]。此外，在弓形蟲組蛋白以及 AP2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中也發(fā)現(xiàn)多個泛素化位點，可能對弓形蟲的轉(zhuǎn)錄具有重要的調(diào)控作用[13]。弓形蟲35%的泛素化蛋白是與細胞周期調(diào)控相關(guān)的，且與磷酸化修飾之間有著重要的相互作用。

　　1.2 小泛素化修飾(SUMOylation)

　　小泛素化修飾是小泛素相關(guān)修飾物與賴氨酸殘基的共價連接過程。弓形蟲的蛋白質(zhì)組中約有1%蛋白質(zhì)發(fā)生SUMO 修飾，并參與轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制和修復(fù)、染色體分離和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等細胞功能[19]。該修飾由 3 種酶進行調(diào)控：E1-SAE1/SAE2 異二聚體(活化酶)、E2/Ubc9(結(jié)合酶)和 E3酶(連接酶)[19]。雖然大多數(shù) SUMO 修飾調(diào)控酶都在細胞核中，但SUMO 修飾的發(fā)生并不局限于細胞核。研究表明，SUMO 修飾在細胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均發(fā)揮重要的作用[19-20]。與靶向蛋白質(zhì)降解的泛素化修飾不 同，SUMO 修 飾 可 以 保 護 蛋 白 質(zhì) 不 被 降解，也可將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細胞中的特定位置，尤其是細胞核[20-21]。HSP70和 HSP90等熱休克蛋白質(zhì)均被檢測到發(fā)生SUMO 修飾，有助于弓形蟲的抗應(yīng)激反應(yīng)，同時 SUMO 修飾在弓形蟲入侵宿主細胞、包囊發(fā)育/維持和發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[19]。盡管泛素化和SUMO 修飾非常相似，但它們具有不可替代的生物學(xué)功能。

　　1.3 棕櫚酰化修飾(palmitoylation)

　　S-棕櫚酰化是棕櫚酸酯(一種飽和 16 碳脂肪酸)通 過 硫 酯 鍵 與 半 胱 氨 酸 殘 基 共 價 連 接 發(fā)生[22-23]。在弓形蟲中共鑒定到282種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，主要位于細胞質(zhì)和細胞膜上。棕櫚酰化通常參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)膜定位、改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等[24]。與其他脂質(zhì)類修飾不同，棕櫚酰化具有可逆性和動態(tài)性。棕櫚酰化修飾由棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶(palmitoylacyltrans-ferases，PATs)催化，弓形蟲基因組編碼18個潛在PATs，其中16個在速殖子中表達[24-25]。因此，棕櫚酰化可能在弓形蟲速殖子階段發(fā)揮重要作用。Foe等[26]證 實 了 肌 球 蛋 白 輕 鏈 (myosinlightchain，MLC1)、肌球蛋白質(zhì) MyoA 以及 GAP45、GAP40、GAP50和 GAP70等滑動體相關(guān)蛋白質(zhì)均發(fā)生棕櫚酰化修飾，這些發(fā)現(xiàn)揭示滑動體是速殖子的一種被高度棕櫚酰化的復(fù)合物。進一步的研究表明，阻斷頂端膜抗原(apicalmembraneantigen1，AMA1)棕櫚酰化可增加 AMA1及微線體相關(guān)蛋白質(zhì)(mi-cronemeproteins，MICs)從頂端復(fù)合體的釋放，表明棕櫚酰化修飾在弓形蟲速殖子的入侵階段扮演著關(guān)鍵的角色。

　　1.4 磷酸化修飾(phosphorylation)

　　磷酸化修飾通過在蛋白質(zhì)氨基酸鏈中添加磷酸(PO3-4 )基團而發(fā)生，是一種對細胞信號傳導(dǎo)非常重要的動態(tài)修飾。此外，磷酸化修飾是弓形蟲和惡性瘧原 蟲 中 最 普 遍 發(fā) 生 的 PTM 類 型，涵 蓋 了 超 過30%的預(yù)測蛋白質(zhì)組[15]。由于蛋白質(zhì)磷酸化可發(fā)生在多種類型的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上，這可能是導(dǎo)致其修飾通量是最高的主要原因之一。在 弓 形 蟲 中，磷 酸 化 修 飾 在 棒 狀 體 蛋 白 質(zhì)(rhoptry neck proteins，RONs 和 rhoptry pro-teins，ROPs)和 致 密 顆 粒 蛋 白 質(zhì) (densegranuleproteins，GRAs)上顯著富集，能夠調(diào)控蟲體入侵宿主細胞的過程[15]。當(dāng)弓形蟲從細胞中釋放出來時，由于營養(yǎng)物質(zhì)的暫時缺乏和外部環(huán)境的壓力刺激，許多蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)被關(guān)閉，這時候磷酸化修飾可以調(diào)控蛋白質(zhì)的功能和活性，從而在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。此外，PKG 是蟲體逸出和侵入細胞的信號中樞，有69種蛋白質(zhì)直接或間接通過其他激 酶 間 接 受 到 PKG 依 賴 性 磷 酸 化 作 用 的 調(diào)控[27]。研究還檢測了被弓形蟲感染的人包皮成纖維細 胞 (HFF)的 磷 酸 蛋 白 質(zhì) 組，共 鑒 定 到 含 有1619個 磷酸化位點的892種蛋白質(zhì)，這將有助于理解弓形蟲與宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及磷酸化蛋白質(zhì)在宿主-病原體中發(fā)揮的作用[28]。總之，弓形蟲磷酸化修飾是極其豐富的，特別是在宿主細胞信號激活/失活、入侵和逸出宿主細胞等過程。

　　1.5 O-糖 基 化 修 飾 (O-GlcNAcylation)、C-甘 露 糖基化修 飾 (C-Mannosylation)和 O-巖 藻 糖 基 化 (O-fucosylation)

　　糖基化修飾主要分為 N-糖基化和 O-糖基化，對弓形蟲的研究主要集中在后者。O-糖基化修飾(O-GlcNAcylation)是由 ON 和 OFF酶(O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶和 O-GlcNAcase)調(diào)節(jié)的高度動態(tài)的 PTM，可以與磷酸化競爭，但其功能尚不清楚[29]。O-糖基化的功能是多種多樣的，包括調(diào)控信號傳導(dǎo)過程，并影響蛋白質(zhì)表達、降解和運輸?shù)萚29-30]。此外，黏蛋白樣糖蛋白的黏蛋白結(jié)構(gòu)域上糖基化的缺失會導(dǎo)致弓形蟲囊壁結(jié)構(gòu)剛性的缺失，這說明糖基化修飾可能參與調(diào)節(jié)弓形蟲細胞壁的相關(guān)結(jié)構(gòu)[31]。

　　C-甘露糖基化是后生動物中存在的血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)序列的常見修飾類型，最近在頂復(fù)門寄生蟲中也被發(fā)現(xiàn)[32-34]。這種糖基化是由 DPY19家族的酶介導(dǎo)，該酶將 α-甘露糖轉(zhuǎn)移至序列 WX2WX2C中色氨酸殘基[34]。C-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性與寄生蟲對宿主細胞的黏附力、運動能力、入侵和逸出宿主細胞等有關(guān)[32，34]。雖然 C-甘露糖基化轉(zhuǎn)移酶 DPY19不是弓形蟲存活所必需的，但對黏附、運動和毒力卻很重要[35]。由于糖基化修飾的調(diào)控機制尚不十分清楚，因此仍然需要徹底研究其對弓形蟲生命周期和致病潛力的影響。

　　弓形蟲 O-糖基化轉(zhuǎn)移酶(OGT)可修飾數(shù)千種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，調(diào)控 O-巖藻糖基化修飾參與轉(zhuǎn)錄，mRNA 加工和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[36]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，O-糖基化轉(zhuǎn)移酶是介導(dǎo) O-巖藻糖基化所必需的，且 O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶“Spindly”會影響弓形蟲的蛋白表達和毒力[36]。盡管 O-巖藻糖基化修飾的許多內(nèi)源蛋白質(zhì)對于速殖子的抗應(yīng)激能力很重要，但 O-巖藻糖基化修飾酶“Spindly”蛋白質(zhì)的敲除試驗證明，它并不是介導(dǎo)弓形蟲 O-巖藻糖基化所必需的。因此，O-巖藻糖基化很可能為弓形蟲提供了一種預(yù)防機制，可以生成和儲備一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)，以加強蟲體對外界環(huán)境的適應(yīng)力。

　　1.6 乙酰化修飾(acetylation)

　　組蛋白乙酰化是涉及弓形蟲生長和發(fā)育的關(guān)鍵PTM 類型，使用液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)成功地在弓形蟲中鑒定到400多個新的乙酰化位點，包括與新陳代謝、翻譯、折疊和細胞骨架等相關(guān)蛋白質(zhì)[37]。活躍增殖的速殖子中富含豐富的賴氨酸乙酰化，這 可 能 與 急 性 弓 形 蟲 病 的 發(fā) 病 機 制 相 關(guān)。AP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過乙酰化修飾來調(diào)節(jié)弓形蟲的基因轉(zhuǎn)錄[38]。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(如 MYST-A、MYST-B、GCN5-A 和 GCN5-B等)以及賴氨酸去乙酰修飾酶 HDACs家族蛋白質(zhì)等，對乙酰化修飾具有重要的調(diào)控作用[39-41]。此外，基于賴氨酸脫乙酰基酶(HDACs)抑制劑(如 FR235222)的抗寄生蟲作用，乙酰化 修 飾 調(diào) 控 酶 可 作 為 潛 在 的 有 效 藥 物 靶標(biāo)[42]。蛋白質(zhì)乙酰化修飾水平與寄生蟲基因型特異性毒力之間具有重要的關(guān)系。在弓形蟲 RH 株中發(fā)生賴氨酸乙酰化蛋白質(zhì)(458個)最多，其次是PYS株(188個)，而在PRU 株中僅檢測到115個乙酰化蛋白[43]。總之，賴氨酸乙酰化在弓形蟲的多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要的功能，對其存活和發(fā)育至關(guān)重要。

　　1.7 精氨酸甲基化修飾(methylation)

　　精氨酸甲基化涉及多種生物學(xué)過程，主要發(fā)生在細 胞 質(zhì) 和 核 蛋 白 上，與 表 觀 遺 傳 和 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 節(jié)、RNA 剪接和 DNA 損傷反應(yīng)等過程相關(guān)[44]。精氨酸單甲基化(monomethylarginine，MMA)修飾大約占 弓 形 蟲 蛋 白 質(zhì) 組 的 5%，主 要 包 括 DNA 和RNA 結(jié)合蛋白質(zhì)等[12]。剛地弓形蟲的精氨酸單甲基化修飾包含大量的 RNA 結(jié)合蛋白和 ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子，這 表 明 精 氨 酸 甲 基 化 修 飾 可 能 在 蟲 體 的RNA 生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。在之前的磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，精氨酸單甲基化的蛋白質(zhì)中有90%被檢測也發(fā)生磷酸化修飾，這增加了弓形蟲中 MMA 與磷酸化之間相互作用的可能性[12]。精氨酸甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)控，弓形蟲基因組含有五種假定的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferases，PRMTs)，其中 PRMT1 對 細 胞 分 裂 和 生 長 起 著 關(guān) 鍵 作用[12，45]。總之，MMA 是 細 胞 核 活 性 的 重 要 調(diào) 節(jié)劑，且 PRMT1是弓形蟲中 MMA 的主要調(diào)節(jié)劑。

　　1.8 琥珀酰化修飾(succinylation)

　　與賴氨酸甲基化和乙酰化相比，賴氨酸琥珀酰化被認為能促進蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)發(fā)生更實質(zhì)性的轉(zhuǎn)化，因為琥珀酰化可以轉(zhuǎn)運更大的結(jié)構(gòu)部分[46]。在生理pH 條件下，賴氨酸殘基上發(fā)生的琥珀酰化可誘導(dǎo)電荷的改變，從而有利于調(diào)節(jié)底物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[47]。由于賴氨酸琥珀酰化引起的結(jié)構(gòu)變化更為明顯，可能會促進蛋白質(zhì)功能發(fā)生更為顯著的變化。研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲中147個蛋白質(zhì)上含有425個獨特的賴氨酸琥珀酰化位點，且參與代謝、表觀遺傳、基因調(diào)控等生物學(xué)功能[46]。此外，研究發(fā)現(xiàn)多個琥珀酰化修飾蛋白質(zhì)[如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物亞基(PDH-E3II)、檸檬酸合酶I(CS1)、烏頭酸水合酶(ACN)、異檸檬酸脫氫酶(IDH、二氫脂酰胺 S-琥珀酰基轉(zhuǎn)移酶(DLST)、琥珀酰 CoA 連接酶亞基 β(SUCL2)、琥珀酸脫氫酶(SDHA)、富馬酸水合酶(FH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)]定位于弓形蟲線粒體或頂質(zhì)體，這對三羧酸循環(huán)、脂肪酸和類異戊二烯合成等均具有重要作用[48]。弓形蟲賴氨酸琥珀酰化涉及多種細胞功能，特別是與能量代謝過程有關(guān)。

　　1.9 N-肉豆蔻酰化修飾(N-myristoylation)

　　在弓形蟲中有157種蛋白質(zhì)會發(fā)生 N-肉豆蔻酰化修飾，且對其生命周期的調(diào)控至關(guān)重要[49]。N-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶(N-myristoyltransferase，NMT)是寄生蟲中必不可少的肉豆蔻酰基化酶。弓形蟲蛋白質(zhì) TGME49_209160(myristoylCoA：proteinN-myristoyltransferase)是 一 種 N-肉 豆 蔻 酰 基 轉(zhuǎn) 移酶，這可能是新的潛在的抗寄生蟲藥物靶標(biāo)[49]。此外，多個肉豆蔻酰化修飾蛋白質(zhì)對弓形蟲運動、入侵和逸出細胞等過程具有重要的調(diào)控作用，如滑動體相關(guān)蛋白質(zhì) GAP45/70，鈣 依 賴 性 激 酶 CDPK1 和CDPK3等[49]。盡管 N-肉豆蔻酰化修飾的通 量 較低，但是仍然扮演著不可或缺的角色。

　　1.10 巴豆酰化修飾(crotonylation)

　　巴豆酰化修飾在細胞、微生物、植物等中均被報道過具有重要的功能[50-51]。通過非標(biāo)定量技術(shù)(la-belfree)和 液 相-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 的 研 究 策 略，在 弓 形 蟲RH 株中共鑒定到有1061個巴豆酰化修飾蛋白質(zhì)(3735個位點)以及在 ME49株中共鑒定到有984個巴豆酰化修飾蛋白質(zhì)(3396個位點)[8，52]。生物信息學(xué)分析表明巴豆酰化修飾蛋白質(zhì)參與調(diào)控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、碳代謝、RNA 轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化、氨酰tRNA 生物合成和蛋白酶體等多種代謝通路，對弓形蟲的生長發(fā)育具有不可或缺的作用。其中弓形蟲 RH 株與 ME49 株在多個重要的代謝調(diào)控酶，如磷酸甘油酸激酶、醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、檸檬酸合酶I、烏頭水合酶等均存在巴豆酰化修飾水平差異，對弓形蟲不同毒力株的能量代謝過程可能具有重要的差異性調(diào)控作用。

　　1.11 二 羥 基 異 丁 酰 化 修 飾 (2-hydroxyisobutyla-tion)

　　賴氨酸2-羥基異丁酰化是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型[53]。通過Labelfree技術(shù)在弓形蟲 RH 株中共鑒定到有1950個二羥基異丁基酰化修飾蛋白質(zhì)(9502個位點)，并在 ME49株中共鑒定到1720個二羥基異丁基酰化修飾蛋白質(zhì)(8092個位點)[8，52]。KEGG 富集分析表明二羥基異丁酰化修飾參與調(diào)控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、碳代謝、氨酰tRNA 生物合成、蛋白酶體、剪切體和氨基酸的生物合成等多種生物學(xué)過程[8，54]。二羥基異丁酰化修飾對弓形蟲肌動蛋白、肌球蛋白、微線體蛋白質(zhì)、棒狀體蛋白質(zhì)以及致密顆粒等均有重要的調(diào)控作用。與弓形蟲 ME49株相比，二羥基異丁酰化修飾可能對弓形蟲 RH 株的修飾程度更高，特別是對其運動、毒力以及入侵宿主細胞的過程有著更重要的調(diào)控作用[8]。此外，相對于其他修飾，二羥基異丁酰化修飾的通量較高(僅低于磷酸化修飾)，對弓形蟲的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

　　1.12 丙二酰化修飾(malonylation)

　　賴氨酸丙二酰化首次是在哺乳動物細胞和細菌細胞中被發(fā)現(xiàn)的，它與脂肪酸合成、氧化和糖酵解過程有關(guān)[55-56]。在弓形蟲中共鑒定到300多個丙二酰化修飾蛋白質(zhì)位于不同的亞細胞區(qū)室，并在糖酵解/糖異生、氨酰基-tRNA 生物合成、磷酸戊糖途徑和脂肪酸 生 物 合 成 等 代 謝 過 程 中 均 發(fā) 揮 重 要 的 作用[57]。其中糖酵解過程重要的調(diào)控酶乳酸脫氫酶(LDH1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)均發(fā)生丙二酰化修飾，可能對弓形蟲能量代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。

　　2 蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的相互作用

　　蛋白質(zhì)翻譯后修飾相互作用發(fā)生在多種 PTMs之間，其目的是共同調(diào)節(jié)弓形蟲多種生物學(xué)過程。弓形蟲具有一種稱為滑動體的獨特機制，主要由在質(zhì)膜下的肌動球蛋白組成[58]。蟲體可以依賴于該機制進行滑動運動，以及進入宿主細胞和從感染細胞中逸出等。弓形蟲滑動體作為多個 PTMs的主要靶標(biāo)，受多種修飾共同調(diào)節(jié)其滑動運動。如在弓形蟲中 TgGAP45是一種滑動體的核心成分，它能夠發(fā)生泛素化、肉豆蔻酰化、棕櫚酰化、二羥基異丁酰化和磷酸化修飾，在滑行運動、入侵和逸出過程中發(fā)揮作用[8，13，59-60]。因 此，PTMs的 之 間 的 相 互 作用對弓形蟲滑動體有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明21%泛素化蛋白質(zhì)也被乙酰化，同時泛素化和乙酰化之間的相互作用可以抑制泛素化修飾從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[61]。此外，磷酸化通常是泛素介導(dǎo)的降解的前提條件，且與甲基化修飾之間也存在相互作用[19，62]。因此，不同 PTMs之間可能具有相互協(xié)同或相互拮抗的作用，從而有序的調(diào)控弓形蟲的生物學(xué)過程。

　　基因表達是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程。組蛋白是染色體中核小體基本結(jié)構(gòu)的重要組成部分，作者繪制了到目前為止已在弓形蟲組蛋白上鑒定出的所有 PTMs修飾圖譜(圖1)，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、磷酸化、巴豆酰化、二羥基異丁酰化、琥珀酰化、泛素化、糖基化等[8，13-14，19，28，38，45]。與組蛋白 H2Ba、H2Ax、H2Bb和 H3相比，弓形蟲組蛋白 H4、H3、H2Ba、H2Bv、H2Az具有更顯著的 PTMs豐富度。此外，大部分組蛋白修飾位點均有多種修飾調(diào)控，其中 H4K32、H4K68、H3K24、H3K28、H3K57、H2BaK71、H2BaK100、H2BaK112、H2AzK10 和H2AzK18具有4種以上的 PTMs，這可能是表觀遺傳調(diào)控的重要修飾位點。因此，弓形蟲組蛋白核心上的 PTMs可能是寄生蟲生長和分化的關(guān)鍵元件，其生物功能調(diào)節(jié)不是由單一類型的修飾完成的，而是由多種修飾的共同調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于弓形蟲不同類型的 PTMs之間的相互作用機制，人們?nèi)匀恢跎伲枰M一步研究。

　　3 討論與展望

　　PTMs是指蛋白質(zhì)翻譯 后 的 動 態(tài) 可 逆 的 化 學(xué)修飾，在蛋白質(zhì)加工和成熟過程中起著重要作用，能夠改變其 理 化 性 質(zhì)，影 響 蛋 白 質(zhì) 的 空 間 構(gòu) 象 和穩(wěn)定性[63-65]。PTMs在弓形蟲生物學(xué) 的 多 方 面 都發(fā)揮重要作用(表1)，包括分化、運動、入侵、逸出、能量代 謝、信 號、傳 導(dǎo)、應(yīng) 激 反 應(yīng)、基 因 轉(zhuǎn) 錄 和 表達、細 胞 周 期 調(diào) 節(jié)、蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 和 定位等[8，12-13，15，19，26，28，34，38，46，59，66-67]。

　　隨著高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進步，PTMs已經(jīng)在許多不同生物中逐漸被解析[68-70]。在但鑒定生物樣品中的PTMs時仍然面臨許多挑戰(zhàn)，如鑒定到的數(shù)據(jù)仍然存在較高錯誤發(fā)現(xiàn)率(falsediscoveryrate，F(xiàn)DR)、樣 品 數(shù) 據(jù) 污 染 以 及 技 術(shù) 方 法 等 問 題[71-72]。此外，傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)在 PTMs的研究中還存在靈敏度不夠等局限性;大多數(shù)的 PTMs在樣本中通量低 (包含低豐度蛋白質(zhì))且具有時空動態(tài)等復(fù)雜性;一些同分異構(gòu)肽段通過質(zhì)譜無法進行準(zhǔn)確有效分離等一系列問題都會影響組學(xué)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。因此在評估數(shù)據(jù)時，必須盡可能考慮所有影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，如數(shù)據(jù)庫的選擇、抗體質(zhì)量、蛋白質(zhì)提取效率、樣品純度、用于搜索數(shù)據(jù)庫的算法、PTM 富集方法等。近期的研究表明，4D蛋白質(zhì)組學(xué)即在保留時間 (retentiontime)、質(zhì) 荷 比 (m/z)、離 子 強 度(intensity)的基礎(chǔ)之上增加了第四個維度———離子淌度(mobility)[73]，使鑒定到的蛋白質(zhì)覆蓋度、檢測周期、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性等方面得到全面提升。未來隨著更多新技術(shù)的出現(xiàn)，人們期待能夠發(fā)現(xiàn)更多的 PT-Ms類型，從而能勾畫一個全面且動態(tài)的宿主細胞與弓形蟲的修飾網(wǎng)絡(luò)譜圖，為更好地解析蟲體與宿主相互作用奠定基礎(chǔ)。同時希望能夠?qū)蜗x不同發(fā)育階段(緩殖子、速殖子和卵囊)之間以及弓形蟲不同表型之間的 PTMs進行動態(tài)且完整的圖譜分析，這將有助于闡明弓形蟲表型轉(zhuǎn)化和毒力變化的潛在機制。

　　PTMs是目前研究最為重要的前沿領(lǐng)域之一，在弓形蟲的生命活動中發(fā)揮著重要的作用。PTMs需要一系列調(diào)控酶來實現(xiàn)正負可逆調(diào)節(jié)，如 PATs、MYST-A、MYST-B、PRMTs、GCN5-A、GCN5-B、HDACs等都 可 能 是 研 制 抗 弓 形 蟲 藥 物 的 重 要 靶標(biāo)[41，74]。目前大多數(shù)弓形蟲 PTMs研究主要還集中在生物信息學(xué)分析層面，未來的研究應(yīng)進一步解析 PTMs的生物學(xué)功能和利用 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)等對重要修飾蛋白質(zhì)進行功能驗證，以揭示 PTMs在剛地弓形蟲中的確切作用。此外，現(xiàn)階段對于弓形蟲的組學(xué)研究相對比較單一，下一步應(yīng)該運用多組學(xué)的聯(lián)合分析的方法(如蛋白質(zhì)組學(xué)、修飾組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等)對弓形蟲及其與宿主細胞相互作用開展重要研究，從而更全面的揭示其生物學(xué)特征，以期為研制新型抗蟲藥物奠定基礎(chǔ)。