去氧紫草素對原代神經元線粒體自噬的影響

　　摘要：目的 基于mt-Keima熒光蛋白研究去氧紫草素對神經元線粒體自噬的影響。 方法 定位于線粒體上的Keima蛋白(mt-Keima)，具有pH敏感性，在中性pH和酸性溶酶體中分別被458 nm和561 nm 激光激發，反映線粒體自噬活性。分離 mt-Keima轉基因小鼠的原代皮層神經元，用自噬抑制劑巴弗洛霉素 A1 (100 nmol·L-1 )處理mt-Keima神經元24 h，激光共聚焦顯微鏡觀察mt-Keima蛋白在細胞內的熒光信號并對線粒體自噬變化進行定量分析，從而檢測mt-Keima線粒體自噬評價體系的可靠性。502個天然小分子化合物處理mt-Keima神經元，通過高內涵成像分析561 nm和458 nm激光下相對熒光強度;用篩選出的去氧紫草素(100 nmol·L-1 )處理神經元24 h，激光共聚焦觀察mt-Keima蛋白的熒光變化并對線粒體自噬變化進行定量分析;免疫熒光檢測原代神經元線粒體外膜受體蛋白 Tom20(Mitochondrial import receptor sub? unit Tom20，Tom20)的表達，進一步反映線粒體自噬水平的變化;四甲基若丹明甲酯染料染色后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化。結果 激光共聚焦顯微鏡結果顯示，神經元細胞表達了mt-Keima 蛋白;與DMSO相比，100 nmol·L-1 巴弗洛霉素A1處理組mt-Keima在561 nm和488 nm 激光下的熒光強度比值下降，表明線粒體自噬水平降低(P<0.01)，此結果說明mt-Keima能夠指示線粒體自噬活性;高內涵分析結果和激光共聚焦的驗證結果表明，與對照組相比，100 nmol·L-1 去氧紫草素處理組mt-Keima在561 nm 以及 488 nm 激光下的熒光強度比值增強，表明線粒體自噬水平增加(P<0.01);免疫熒光結果表明去氧紫草素處理后Tom20蛋白的表達下調(P<0.01)，誘導了線粒體自噬;激光共聚焦顯微鏡結果顯示在去氧紫草素處理組，神經元細胞線粒體膜電位無變化。結論 去氧紫草素在不造成線粒體損傷的前提下促進神經元的線粒體自噬。

　　本文源自路丁乙; 李婷; 姚鋮鋮; 陳佳意; 趙潔; 韓秋影; 李愛玲; 潘欣， 中國藥理學與毒理學雜志 發表時間：2021-05-09《中國藥理學與毒理學》雜志，于1986年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:11-1155/R，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：論著、方法、綜述等。

　　關鍵詞：線粒體自噬;mt-Keima;去氧紫草素

　　神經元主要依賴氧化磷酸化來產生能量，因此線粒體健康狀態對于神經元功能至關重要[1]。線粒體自噬(mitophagy)是自噬的一種，即通過自噬方式特異性去除受損的線粒體，是維持線粒體質量控制的關鍵環節。鑒于神經元的特殊功能，神經系統的線粒體自噬水平非常活躍。神經元線粒體自噬與衰老以及神經退行性疾病密切相關，神經元線粒體自噬異常會導致細胞內受損的線粒體累積，進一步誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，導致線粒體過度破裂，引起細胞損傷，從而加速機體衰老進程[2]。因此，通過藥理學方法增加或者恢復線粒體自噬作用，為延緩衰老以及治療神經退行性疾病開發新的治療靶點，已成為研究的一大熱點[3-4]。

　　為開發潛在的促進線粒體自噬的化合物，本研究從包含 502 個天然小分子化合物庫中篩選促進神經元線粒體自噬的小分子，進而篩選到去氧紫草素這一小分子。紫草素是從天然的中草藥紫草中提取的活性物質，具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等多種活性[5-7]。目前尚未報道該化合物能夠促進神經元的線粒體自噬。本實驗通過分離 mt-Keima 轉基因小鼠[8](具有全身線粒體定位的 Keima 蛋白)的原代皮層神經元，驗證了去氧紫草素能夠促進神經元的線粒體自噬，此研究為治療神經退行性疾病提供了新的方向。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物、試劑和儀器

　　mt-Keima轉基因小鼠來自美國杰克森實驗室，庫存號：028072;;C57BL/6來自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016- 0006。神經元基礎培養基、胎牛血清、N-2、B27 無血清添加劑、DMEM 高糖培養基都來自美國 Gibco 公司;馬血清來自北京中杉金橋生物技術有限公司;青霉素-鏈霉素雙抗、多聚賴氨酸來自中科邁晨北京科技有限公司;胰蛋白酶來自美國 Sigma 公司;Lab-Tek 八腔室、四甲基羅丹明乙酯(Tetra? methylrhodamine，TMRM)來自美國 Thermo Fisher 公司;巴弗洛霉素 A1 來自美國 Selleck 生物科技有限公司;去氧紫草素(純度 99.36%)來自上海陶素生化科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(Carbonyl cy? anide 3 - chlorophenylhydrazone，CCCP)來 自 美國 Sigma公司;線粒體外膜受體蛋白Tom20(Mito? chondrial import receptor subunit Tom20，Tom20)鼠單克隆抗體來自美國 Santa Cruz 公司;羊抗鼠 Alexa Fluor 488和 Hoechst 細 胞核染料來自美國 Thermo Fisher Scientific公司，熒光封片劑(含DAPI)來自北京中杉金橋公司;黑色96孔板來自美國Per? kin Elmer 公司。激光共聚焦熒光顯微鏡來自德國 Zeiss 公司;倒置相差顯微鏡來自日本 Nikon 公司;高內涵成像分析儀來自美國Perkin Elmer公司。

　　1.2 神經元的分離及培養

　　實驗室繁殖得到的 mt-Keima 轉基因小鼠和維通利華公司購得野生型 C57BL/6孕鼠，按照本實驗已有的方法分離原代皮層神經元[9]，分離好的神經元種于接種液(含10%的胎牛血清、馬血清以及1% 的青霉素-鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養基)中，于 37℃，5% CO2的恒溫培養箱培養 6 h 后，換為神經元培養基(含 2% 的 B27、1% 的 N-2、谷氨酰胺以及青霉素-鏈霉素雙抗混合液的Neurobasal 基礎培養基)繼續培養，體外培養6~7 d可進行實驗。

　　1.3 檢測mt-Keima熒光蛋白在原代神經元細胞中的表達

　　分離得到的 mt-Keima 轉基因小鼠的原代神經元按照每孔 2×104 個細胞均勻種在Lab-Tek八腔室中，在體外培養 7 天，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發光下檢測細胞的發光情況。

　　1.4 檢測巴弗洛霉素A1對神經元線粒體自噬的影響

　　分離得到的 mt-Keima 轉基因小鼠的原代皮層神經元，在體外分化第6天時，分別用100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(實驗組)和相同濃度的 DMSO(對照組)處理 24 h 后，將加藥后的神經元置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發光下檢測細胞的發光情況，利用 Volocity 軟件處理拍攝后的圖像，統計每個細胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值表示線粒體自噬水平。

　　1.5 高內涵篩選促進神經元線粒體自噬的化合物

　　96 孔板提前 1 h 鋪上多聚賴氨酸，之后用高壓過的無菌水清洗2次，晾干待用。mt-Keima轉基因小鼠的神經元細胞按照 2×10^ 4 個每孔種于 96孔板中。神經元細胞培養第 6 天，每孔加入不同的天然小分子化合物(共 502 個)，處理 24 h 后，將孔板放入高內涵儀中進行掃描。利用高內涵數據分析軟件進行分析，計算細胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值(線粒體自噬指數)用來表示線粒體自噬水平。

　　1.6 去氧紫草素促進神經元線粒體自噬的檢測

　　分離得到的 mt-Keima 轉基因小鼠的原代皮層神經元，在體外分化第 6天時，分別用 100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(實驗組)和相同濃度的 DMSO(對照組)處理 24 h 后，之后將神經元置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發光下檢測細胞的發光情況，利用 Volocity 軟件處理拍攝后的圖像，統計細胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值表示線粒體自噬水平。

　　1.7 神經元線粒體膜電位的測定

　　分離得到的 C57BL/6 野生型小鼠的神經元細胞，在體外分化第6天時，實驗組分別用100 nmol·L-1 去氧紫草素處理24 h和10 μmol·L-1 羰基氰化物間氯苯 腙(Carbonyl cyanide 3 - chlorophenylhydrazon， CCCP)處理 12 h，其中 CCCP 為線粒體解偶劑，破壞線粒體膜電位，可作為本實驗的陽性對照。處理 24 h的溶劑(DMSO)作為對照組，吸棄八腔室中的神經元培養基，用神經元培養基稀釋四甲基若丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)，終濃度為 100 nmol·L-1 ，配置成 TMRM 的染色液，在 37℃孵育 30 min，孵育結束后，吸棄染色液，用 PBS緩沖液洗滌細胞一次，培養液換成新鮮的神經元培養基，Hoechst(1∶1000)溶于 PBS 緩沖液中染核 8 min，之后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察掃描。

　　1.8 免疫熒光檢測神經元Tom20的表達

　　將 Platinum Line Cover Glass 玻片置于 24 孔板內，加入 300 μL 的多聚賴氨酸置于 37℃培養箱 1 h 后，每孔接種 4×10^ 4個 C57BL/6 野生型小鼠的原代皮層神經元細胞，在體外分化第6天時，分別用 100 nmol·L-1去氧紫草素(實驗組)和相同濃度的DMSO(對照組)處理24 h。細胞用4%的多聚甲醛在37℃敷箱固定15 min(多聚甲醛需要提前預熱)，用1×PBS清洗1次，之后用含有0.3%的Triton-100 的PBS打孔10 min。用含3%羊血清的PBS(封閉液)室溫封閉 1 h 后，一抗 Tom20(1∶400)4℃ 孵育過夜，熒光二抗 Alexa Fluor 488(1∶400)室溫孵育 1 h，最后用熒光封片劑(含 DAPI )封片，室溫晾干后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

　　1.9 統計學分析

　　使用 GraphPad Prism6.0 軟件對數據進行統計學分析，實驗結果數據以x±s表示，兩組間采用雙樣本 t檢驗分析，多組間采用單因素方差分析比較， P<0.05 為差異有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 mt-Keima熒光蛋白在原代神經元細胞中表達

　　將分離的 mt-Keima 轉基因小鼠的原代皮層神經元體外培養 7 天后，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細胞在 458 nm 激發的熒光(標記為綠色)有很好的線粒體定位，形狀為絲網狀，用于指示中性胞漿中的線粒體;在 561 nm 激發下有明顯的點狀聚集(標記為紅色)，指示進入酸性溶酶體中的線粒體。共聚焦熒光顯微鏡觀測的結果顯示，mt-Keima熒光蛋白在原代神經元細胞中表達，且本底具有一定的線粒體自噬水平(圖1)。

　　2.2 mt-Keima能夠指示線粒體自噬活性

　　為驗證 mt-Keima 能夠反映線粒體自噬，使用自噬抑制劑巴弗洛霉素 A1 處理原代神經元，在激光共聚焦熒光顯微鏡下檢測 mt-Keima 熒光信號。與DMSO組相比，巴弗洛霉素A1(100 nmol·L-1 )處理后的神經元細胞，mt-Keima蛋白的酸性熒光信號(紅色)減弱，線粒體自噬水平(561 nm 熒光信號強度/458 nm 熒光信號強度)下降(P<0.01)。以上結果說明，mt-Keima能夠很好的指示線粒體自噬活性(圖2)。

　　2.3 去氧紫草素能夠促進神經元線粒體自噬水平

　　根據高內涵的篩選結果(圖3B)，發現去氧紫草素處理后，線粒體自噬水平(561 nm熒光信號強度/ 458 nm熒光信號強度)明顯高于DMSO組，提示去氧紫草素可能能夠促進神經元的線粒體自噬。隨后對該結果進行驗證。將分離得到的 mt-Keima轉基因小鼠的神經元細胞，給予 100 nmol·L-1 去氧紫草素處理后，與 DMSO 組相比，神經元細胞中 mtKeima蛋白的酸性熒光信號(紅色)增強(圖3C)，指示進入溶酶體中的線粒體增多，線粒體自噬水平(561 nm 熒光信號強度/458 nm 熒光信號強度)增加(P<0.01)。以上結果說明，去氧紫草素能夠促進神經元的線粒體自噬。

　　2.4 去氧紫草素促進線粒體外膜蛋白Tom20的降解

　　Tom20是線粒體外膜的標志蛋白，在線粒體自噬過程中發生降解。免疫熒光結果表明，與對照組相比，去氧紫草素(100 nmol·L-1 )處理后的神經元細胞Tom20蛋白水平降低(P<0.01)，表明去氧紫草素促進線粒體的降解，線粒體自噬活性增強(圖4)。

　　2.5 去氧紫草素不影響神經元線粒體膜電位

　　如圖5顯示，陽性對照CCCP處理后的神經元，細胞紅色熒光信號降低，表明線粒體膜電位下降(P<0.01)。去氧紫草素處理后的細胞與 DMSO 組相比，細胞都呈現較強的紅色熒光，表明線粒體膜電位較高。以上結果說明，去氧紫草素不影響神經元的線粒體膜電位。

　　3 討論

　　線粒體是細胞中的代謝中心和信號樞紐[10]，研究表明，線粒體功能障礙已經成為多種神經退行性疾病的的共同特征[1 1 - 1 3]，因此清除受損的線粒體，維持線粒體的正常功能，對于改善神經退行性疾病有著重要的意義。由于神經元的再生能力低，能量需求高，線粒體自噬活性對神經元的健康狀態至關重要[1 4 - 1 5]。Keima具有 pH敏感性，且不易被溶酶體進行降解的特性，目前已被應用于檢測自噬。 Katayama 等人將線粒體定位序列與 Keima 進行融合表達[1 0]，將 Keima定位于線粒體，用于指示線粒體自噬。Sun 等人構建了 mt-Keima 轉基因小鼠的模型，可以在體內更加生理地分析線粒體自噬過程[8]。本實驗分離mt-Keima轉基因小鼠的神經元，經巴弗洛霉素A1處理后，神經元線粒體自噬被抑制，證明了mt-Keima可用于指示線粒體自噬活性。

　　靶向線粒體自噬，通過藥理學手段提高線粒體自噬水平，為干預衰老以及年齡相關的疾病提供新的途徑，也是目前研究的熱點[1 6 - 1 8]。天然化合物在自然界中廣泛存在，一般毒副作用小。目前報道誘導線粒體自噬的幾種天然化合物，如尿石素A、亞精胺或煙酰胺單核苷酸等，可以保護細胞并達到延緩衰老的作用[16，19-20]。然而，已報道的能夠促進線粒體自噬的化合物能夠在臨床中得到廣泛應用的還非常少，因此開發新的促進神經元線粒體自噬的化合物，具有重要的科學意義和臨床意義。基于 mtKeima 體系篩選出來的天然小分子化合物去氧紫草素能夠促進神經元的線粒體自噬水平，并且通過免疫熒光實驗得到了進一步的驗證。線粒體膜電位是反映細胞內線粒體功能狀態的重要參數之一，本研究發現在 100 nmol·L-1 去氧紫草素處理下，并不影響神經元的線粒體膜電位，說明去氧紫草素能夠在不造成線粒體損傷的前提下促進神經元的線粒體自噬。由于神經元較為敏感，在高劑量去氧紫草素的處理下，神經元會發生死亡。因此本實驗選擇了100 nmol·L-1 進行研究，在該劑量處理下，去氧紫草素既不影響神經元細胞的活力狀態，又能夠最大程度誘導線粒體自噬。

　　已知磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphoinositide 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)/ 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy? cin，mTOR)途徑是細胞自噬的重要通路，目前有研究表明，紫草素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導宮頸癌細胞、乳腺癌細胞發生自噬[21-22]，從而起到殺傷腫瘤細胞的作用。因此去氧紫草素促進神經元的線粒體自噬是否也是靶向 PI3K/AKT/ mTOR信號通路，有待進一步的研究和探索。

　　本研究發現，去氧紫草素能夠安全有效地促進神經元的線粒體自噬。因此，去氧紫草素在延緩衰老和治療神經退行性疾病方面可能也有著很重要的應用前景，也為治療衰老以及年齡相關的疾病提供新的思路。