EuDQD/SDH6基因在巨尾桉莽草酸途徑中的功能分析

　　摘 要 莽草酸脫氫酶家族是多酚類物質合成的關鍵分支酶，本研究體外分離獲得巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因(KY401152.1)，在大腸桿菌中表達并純化了 DQD/SDH6 蛋白，以莽草酸為底物的 DQD/SDH6 酶動力學參數為 Km=29.93 mmol/L，Vmax=(149.96±0.003) mmol L-1 s -1，表明該蛋白具有 SDH 活性。實時定量 PCR 技術研究 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表達特性，發現 EuDQD/SDH6 主要在葉片中表達，其次是莖部，根部最少，隨著葉片的成熟 EuDQD/SDH6 的表達量也逐漸減少。綜合分析了實時定量 PCR、SDH 酶活性和 HPLC 法測定的酚酸含量的數據，研究巨尾桉 DQD/SDH6 的酶功能。EuDQD/SDH6 的基因表達量與 SA、 PCA 累積量均呈負線性相關，與 GA 累積量正線性相關，但關聯性較弱，推測桉樹 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3 脫氫莽草酸為底物合成沒食子酸，為單寧合成提供前體。EuDQD/SDH6 基因的表達量與硫酸木質素的含量呈正相關，推測 EuDQD/SDH6 基因的表達影響木質素在巨尾桉中的累積。

　　本文源自趙艷玲; 王梅， 分子植物育種 發表時間：2021-05-10《分子植物育種》(雙月刊)創刊于2003年，由海南省生物工程協會主辦。是一份為轉基因育種、分子標記輔助育種及常規育種服務的國際化科學期刊，內容涉及了水稻、小麥、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯類、果樹、蔬菜、花卉、茶葉、林草等多方面，主要是刊登分子遺傳育種理論、分子育種方法、分子育種研究動態以及優良種質培育的科學論文報道。

　　關鍵詞 巨尾桉; 莽草酸脫氫酶; 沒食子酸; 莽草酸; 原兒茶酸; 木質素

　　微生物和植物中的芳香族氨基酸及大量次級代謝物如鞣酸、單寧等通過莽草酸途徑獲得必要的前體。莽草酸脫氫酶(簡稱 SDH)家族分為五類功能酶，具有高度保守的 α/β 折疊三維結構，因活性中心殘基和幾何結構的輕微不同而具有不同的底物特異性(Peek and Christendat, 2015)。植物莽草酸脫氫酶基因的沉默會影響植物的莖高生長并出現芳香族氨基酸缺乏等現象(Ding et al., 2007)。

　　在植物中，SDH 通過 N 端與脫氫奎寧酸脫水酶(DQD)結合，形成 DQD/SDH 復合酶。不同的植物因生理特性不同，具有不同的 DQD/SDH 基因數量，在耐鋁脅迫的赤桉(Tahara et al., 2021)，成熟的葡萄果實 (Bontpart et al., 2016)、石榴的外表皮(Guo et al., 2014)和山茶的葉片(Huang et al., 2019)中分離到四類 DQD/SDH 基因，白楊編碼五種 DQD/SDH 基因(Habashi et al., 2019)。赤桉 EcDQD/SDH1 為經典的植物 DQD/SDH 雙功能酶，EcDQD/SDH4a/b 為依賴 NAD+/NADH 的奎尼酸脫氫酶，EcDQD/SDH2 和 3 為鋁的解毒代謝物的生物合成提供必需的沒食子酸鹽(Tahara et al., 2021)。白楊的 poptr1 和 poptr5 皆有典型的 DQD/SDH 雙功能特性，而 poptr2 和 poptr3 則以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+ )為輔因子催化奎尼酸形成 3- 脫氫奎尼酸，具有奎尼酸脫氫酶(QDH)活性，DQD 和 SDH 活性最少，只占總活性的 1% (Guo et al., 2014)。

　　莽草酸脫氫酶作為多酚類物質合成的關鍵分支酶，而酚酸種類豐富且大量的巨尾桉具有不同于其他植物的特點。本研究分離了巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因，通過實驗設計綜合分析該基因在巨尾桉莽草酸脫氫酶家族中的酶功能，為進一步解析桉樹莽草酸脫氫酶家族奠定研究基礎。

　　1 結果與分析

　　1.1 巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因的分離與生物信息學分析

　　根據桉樹基因組數據設計引物，分離純化約 1500bp 符合目的基因的條帶，委托華大基因公司測序， Genebank 注冊號 KY401152.1。EuDQD/SDH6 開放閱讀框全長為 1593bp，預測分子量為 57.48kD，等電點為 7.36。利用在線 IterPro 預測 EuDQD/SDH6 屬于莽草酸脫氫酶超家族，也屬于脫氫奎尼酸脫水酶第一類。利用 MEGA5.0 檢測其他不同植物的 DQD/SDHs 的序列相似性，構建鄰接樹如圖(圖 1)。結果表明 EuDQD/SDH6 與 VvSDH3、EgSDH3、FvSDH1 等屬于 DQD/SDH 第三分類，平均序列相似性為 85%，猜測 EuDQD/SDH6 功能可能是以 GA 為前體合成單寧，在植物體內積累水解單寧(Bontpart et al., 2016)。

　　1.2 EuDQD/SDH6 的原核表達和酶動力學

　　圖中表明 PET-euDQD/SDH6 原核表達載體構建成功(圖 2)，預測 PET-euDQD/SDH6 融合蛋白條帶可能在 60~70kD 附近，獲得原核表達的融合蛋白(圖 3)。用 Ni-NTA-瓊脂糖親和純化 His6 標記的重組蛋白，根據 Michaelis-Menten 線性擬合得到最大速率 Vmax 和米氏常數 Km (表 1)，以莽草酸為底物、NADP+為輔因子的緩沖環境中，DQD/SDH6 的 Km 值為(29.93±0.17) mmol/L，具有功能特性的 DQD/SDHs，其重組酶 Km 值范圍大都在 130~860 μmol/L 之間(Ding et al., 2007; Muir et al., 2011;Tahara et al., 2021; Habashi et al., 2019)，說明 DQD/SDH6 以莽草酸為底物的莽草酸脫氫酶活性較低。

　　1.3 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表達模式

　　以 18S 為內參基因 qPCR 檢測巨尾桉組培苗中 EuDQD/SDH6 在不同組織中的表達模式，EuDQD/SDH6 主要在葉片表達，其次是莖部，在根系表達量極低，以根系為對照，EuDQD/SDH6 在葉片的表達量是根系的 20 倍左右(圖 4A)。且 EuDQD/SDH6 主要在幼齡葉中表達，隨著葉片的成熟表達量隨之降低，上層幼齡葉的表達量是下層老齡葉表達量的 121 倍(圖 4B)

　　定量 PCR 技術篩選實驗室保存的木質素含量降低的轉基因巨尾桉 P40、P41 (趙艷玲等, 2018)、F52、 F71、F76 (趙艷玲等, 2019)的 EuDQD/SDH6 基因表達水平，P40、P41 是過表達 CuZnSOD 的轉基因桉樹， F52、F71、F76 是過表達 CuZnSOD+低表達 4CL1 基因的轉基因桉樹，篩選到三株 P41、F52、F71 轉基因植株的 EuDQD/SDH6 基因表達水平較低，其中 F52 的 EuDQD/SDH6 表達水平最低，與對照組相比下降了 91%。

　　1.4 轉基因巨尾桉的 SDH 酶活測定

　　檢測篩選的 5 株轉基因巨尾桉的 SDH 酶活性，與野生植株相比，轉基因巨尾桉的 SDH 活性均有增加，其中 F71 的比活力最高，高達(3.45±0.29)×107 nmol·min-1 ·mg -1，是對照組的 2.22 倍。

　　1.5 轉基因巨尾桉的莽草酸、沒食子酸和原兒茶酸含量

　　轉基因巨尾桉的莽草酸含量均高于對照組，其中植株 F52 莽草酸累積量增加 1.12 倍，而植株 P41 的莽草酸累積量增加 8.19 倍。GA 累積量均低于野生型巨尾桉，并呈現不同程度的減少，其中植株 P40 的 GA 累積量降幅最大，與對照組相比降低 55.75%。轉基因巨尾桉 P41、F52、F71、F76 的 PCA 累積量均小幅度的高于野生型巨尾桉，其中 P41 的原兒茶酸含量相對于對照組增加 3.28 倍，與之相反的是植株 P40 的 PCA 累積量呈現輕微的減少。

　　1.6 EuDQD/SDH6 與酚類物質含量的相關性

　　轉基因桉樹的硫酸木質素含量數據參照文獻 [11,12]，以 EuDQD/SDH6 基因表達水平與硫酸木質素含量之間計算，二者的相關系數 r≈0.64，呈顯著正線性相關，EuDQD/SDH6 基因可能影響木質素在巨尾桉中的積累。以轉基因巨尾桉 SDH 總酶活與硫酸木質素含量計算二者之間的相關系數 r≈-0.88，說明 SDH 的高表達會降低轉基因巨尾桉中木質素的累積量。

　　EuDQD/SDH6 的基因表達水平與 SA、PCA 累積量之間呈負線性相關，但 SDH 酶活與 SA 累積量之間呈正線性相關，與 PCA 累積量的正線性相關相對較弱。數據表明 EuDQD/SDH6 基因表達與 GA 累積量之間存在正線性相關，但該關聯性較弱，而 SDH 酶活與轉基因巨尾桉的 GA 累積量之間存在著較弱的負線性相關。

　　2 討論

　　Bontpart 等(2016)分析部分雙子葉植物的 DQD/SDH 基因序列，將其分成五類：第一類葡萄 VvSDH1、擬南芥 AtSDH(Tahara et al., 2021)、胡桃 JrSDH (Muir et al., 2011)、煙草 NtSDH1 (Ding et al., 2007)，序列相似性達 75%;第二類葡萄 VvSDH2、楊樹 poptr2、poptr3 和煙草 NtSDH2，序列相似性平均為 71%;第三類 VvSDH3、野茶樹 CasSDH2 (Jiang et al., 2013)、草莓 FvSDH1 (Rivas-Sendra et al., 2011)和桉樹 EgSDH3(Boulekbache-Makhlouf et al., 2010)序列相似性最高，高達 85%;第四類葡萄 VvSDH4 和楊樹 poptr5, 序列相似性為 77%;第五類楊樹 poptr4 和桉樹 EgSDH1 等，目前未見生理特性的研究分析，序列相似性平均為 68%。本研究構建的鄰接樹里，EuDQD/SDH6 與 VvSDH3、CasSDH2、FvSDH1 等歸為第三類植物 DQD/SDH，而先前已經有研究證明這四種植物體內積累較高的以 GA 為底物合成的單寧化合物，因此推測桉樹 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3-DHS 為底物合成沒食子酸，為單寧合成提供前體。

　　利用統計學計算公式分析酚酸含量與 EuDQD/SDH6 基因、SDH 酶活和木質素含量之間的相關性，結果發現 SA、PCA 含量與 EuDQD/SDH6 之間呈負線性相關，相關系數分別為-0.51、-0.50，-0.51、-0.57，但與 SDH 酶活之間卻呈正線性相關，相關系數分別為 0.61、0.38，說明在巨尾桉中具有一個復雜的莽草酸脫氫酶家族。EuDQD/SDH6 的基因表達水平能較弱的影響 GA 在植物體的累積量;GA 累積量也受 SDH 酶活的影響，當 SDH 酶活力增加時，GA 累積量呈下降趨勢，暗示 GA 的合成與 SDH 家族酶關系較小。推測可能存在其他合成 GA 的酶，其以莽草酸作為底物催化產生 GA 的能力較差，或者是否在桉樹中存在 GA 合成相關的抑制作用，這些推測還尚未得到證明(Wu and Dutta, 2017)。3-脫氫莽草酸作為中間物既能被 SDH 催化形成 SA，又能被催化生成 GA，而 3-DHS 到 PCA 的途徑在植物中的研究尚不清晰，此步驟在植物中是由酶催化的還是無酶催化的還未有定論(Wu and Dutta, 2017; Kim et al., 2018)。

　　統計學方法分析硫酸木質素與 SDH 酶活之間的相關性，結果發現二者之間相關系數為-0.88，表明 SDH 的過量表達能顯著降低轉基因巨尾桉中木質素的累積。在擬南芥中表達棒狀桿菌的脫氫莽草酸脫水酶基因，該酶催化 3-脫氫莽草酸生成 PCA，降低了轉基因植物細胞壁木質素的堆積(Eudes et al., 2016)。至于 SDH 表達水平的變化是否能改變木質素的累積量還要通過構建 SDH 轉基因植株來進一步驗證。

　　3 材料與方法

　　3.1 試驗材料

　　巨尾桉組培苗、盆栽苗、轉基因苗、大腸桿菌 E.coli DH5α、E.coli BL21、pET-32a 等為本實驗室保存。 cDNA 合成試劑盒、RNA 提取試劑盒、定量 PCR 試劑盒和相關的酶試劑購自 TaKaRa，His-tag Protein purification Kit(常州天地人和生物科技)。

　　3.2 基因分離與生物信息學分析

　　參照巨尾桉 RNA 克隆方法(趙艷玲和姚婕, 2017)，設計引物 EuDQD/SDH6：SDH6F：5’ATGGGCAGCG TTCCGTTCAC 3’，SDH6R：5’ATGGGCAGCGTTCCGTTCAC 3’，分離陽性克隆子，委托華大基因測序，NCBI 數據庫注冊基因序列。蛋白質家族及保守功能結構域預測 InterProScan (http://www.ebi.ac.uk /Tools/InterPro Scan/)，MEGA5.2 建鄰接樹。

　　3.3 基因原核表達和酶活性測定

　　BamH?和HindⅢ雙酶切pMD-SDH和pET-32a連接構建PET-euDQD/SDH6，并委托華大基因測序。IPTG 誘導 DQD/SDH6 蛋白表達，參照(Habashi et al., 2019)誘導重組蛋白。Ni-NTA beads 6FF 親和純化 His6 標記重組蛋白，Bradford 法測定蛋白含量，EuDQD/SDH6 酶動力學參數以莽草酸(SA)為底物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+ )為輔因子、pH=7 的條件下檢測。

　　3.4 實時定量 PCR 測定基因表達量

　　參照(趙艷玲和姚婕, 2017)利用定量 PCR 方法分析巨尾桉組培苗的三個植物組織(根, 莖, 葉)、1 年生轉基因桉樹盆栽苗不同葉齡(幼葉, 中葉, 老葉)的 EuDQD/SDH6 表達量，以巨尾桉 18s rRNA 為內參基因 Eg18S3：5’CATGGCCGTTCTTAGTTGGT3’，Eg18S4：5’TAGCAGGCTGAGGTCTCGTT3’，EuDQD6(1)： 5’CATTGTGAGAAGGCCTGATG3’，EuDQD6(2)：5’CAGCTAATGGTGAGGCTCCT3’，依相對定量法計算 EuDQD/SDH6 基因的表達量。

　　3.5 轉基因巨尾桉 SDH 活性測定方法

　　液氮研磨巨尾桉葉片約 2 g，4 mL 蛋白提取緩沖液抽提，4 ℃ 13 000 g 離心 25 min，取上清為 SDH 蛋白粗提液。Bradford 法測定蛋白含量，以莽草酸(SA)為底物、NADP+為輔因子，紫外分光光度計測定 5 min 內 NADPH 在 340 nm 的吸光度值變化測定莽草酸脫氫酶活性，計算酶活和比活(Bontpart et al., 2016)。

　　3.6 HPLC 法測定莽草酸、沒食子酸和原兒茶酸

　　液氮研磨葉片，收集 2.0 g 粉末于錐形瓶中，加入 20 mL 的 50%甲醇。超聲儀中提取 60 min，待錐形瓶冷卻至室溫稱重，用 50%甲醇補足重量。0.22 μm 濾膜過濾。HPLC 儀器為 Agilent 高效液相色譜儀，色譜柱為 welch XB-C18 柱(4.6 mm×150 mm, 3 μm)。流動相為乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 218 nm 測定莽草酸(SA)含量;流動相為甲醇-0.1%磷酸(5:95)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 270 nm 測定沒食子酸(GA)含量;流動相為乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 258 nm 測定原兒茶酸(PCA)含量。

　　3.7 酶活性、基因表達量和次級代謝物的相關性

　　以統計學方法計算 EuDQD/SDH6 的表達水平及 SDH 酶活的大小與植物中各類次級代謝物的含量的關系，相關系數計算公式如下：相關系數 r= x、y：兩個指標

　　作者貢獻

　　趙艷玲、王梅是本研究的實驗設計和實驗研究的執行人;王梅完成數據分析，論文初稿的寫作;趙艷玲是項目的構思者及負責人，指導實驗設計，數據分析，論文寫作與修改。兩位作者都閱讀并同意最終的文本。

　　致謝

　　本研究由福建省科技廳引導性科研項目(2018N0018)資助。