LmNotch基因在飛蝗翅發育中的功能分析

　　摘要：Notch 是 Notch 信號通路中的受體蛋白，與配體結合后調控下游靶標基因的表達，在無脊椎動物和脊椎動物的發育和分化過程中發揮著重要的作用。本文以飛蝗為研究對象，利用轉錄組數據庫搜索獲得 Notch 信號通路受體基因 LmNotch，并利用 qRT-PCR 對 5 齡飛蝗不同組織及不同發育時期翅芽組織中的 LmNotch 表達特性進行了分析。通過 RNA 干擾試驗對其生物學功能進行分析，發現注射 dsLmNotch 的飛蝗有 70%無法完成蛻皮過程，10%的飛蝗在蛻皮后出現翅紊亂表型。飛蝗翅芽石蠟切片的 H&E 染色結果表明，處理組翅上下兩層表皮之間腔空間增大，新表皮無法完整形成。qRT-PCR 檢測其他翅發育相關基因表達發現， LmNotch 表達量的下降影響翅發育相關基因 Dpp、Omb、Yorkie 以及翅特異表皮蛋白基因的表達。上述研究結果可為昆蟲翅發育機制研究提供理論基礎，同時為害蟲生物防治提供潛在靶標。

　　徐子龍; 張福斌; 武兆辰; 張晶; 張建珍; 趙小明， 中國生物防治學報 發表時間：2021-09-16

　　關 鍵 詞：飛蝗;RNA 干擾;翅發育;Notch

　　昆蟲是世界上數量最多、種類最大的生物類群，也是唯一一種進化出了飛行能力的無脊椎動物。翅在昆蟲遷飛、求偶、覓食和躲避敵害等方面具有重要作用[1]。昆蟲的翅是由外胚層發育而來，完全變態昆蟲是由保留在幼蟲體內的器官芽經過完全變態發育成為完整的翅，如黑腹果蠅 Drosophila melanogaster 等;漸變態昆蟲則由若蟲的“翅芽”經過不完全變態發育成為完整的翅，如飛蝗 Locusta migratoria 等[2]。因此，對昆蟲翅發育過程的研究將有助于了解昆蟲的變態。昆蟲翅發育的控制是一個非常精確和復雜的過程。目前，對昆蟲翅發育機制的研究主要來自黑腹果蠅[3]。在果蠅中，翅的發育受到 Decapentaplegic(Dpp)、Wingless (Wg)、Hedgehog(Hh)、Hippo、Notch 以及 JNK 等信號通路的調控[4-6]，而且在許多不同的動物中，這些信號通路在進化上是高度保守的。目前，在很多模式昆蟲中這些信號通路中的一些影響翅發育的關鍵基因已被鑒定出來，如黑腹果蠅和赤擬谷盜 Tribolium castaneum 等[7-10]。

　　Notch 信號通路在動物中是高度保守的，在細胞發育過程中控制細胞命運，并維持成體組織的穩態[11,12]。Notch 信號通路主要由 Notch 受體、Notch 配體(Delta(Dl)，Serrate(Ser))、 CSL(C promoter binding factor-1 (CBF1), Suppressor of hairless (Su(H)), Lag-1)轉錄因子、其他效應子與 Notch 調節分子構成[13]。其激活依賴于一個細胞膜上的配體與相鄰細胞的 Notch 受體結合，這種結合使得 Notch 的胞內結構域 NICD(intracellular domain of Notch)的釋放，之后進入細胞核內與轉錄因子 CSL 結合，調控其下游的基因表達[14,15]。Notch 是一個 300 kDa 的單次跨膜蛋白，由一個大的胞外區域、一個單一的跨膜部分和一個小的胞內區域組成[16]，其中胞外結構域由多個數量不同的 EGF(epidermal growth factor)重復單元、3 個 Lin12/Notch repeats(LNRs)和一個鄰近跨膜結構域組成，胞內結構域包括一個 RAM(recombinationbinding protein-J–associated molecule)區域、7 個錨蛋白重復結構域(Ankyrin)、一個反激活區域(transactivation domain (TAD))和一個 C 末端區域[11]。在昆蟲翅發育研究中，Notch 信號通路直接參與果蠅背部翅原基邊界的形成以及翅細胞的增殖分化[17]。然而，在非模式昆蟲中翅發育相關基因的鑒定及功能仍不清楚。

　　飛蝗是一種典型的漸變態昆蟲，也是世界性農業害蟲。本文以 Notch 信號通路受體為研究對象，探討其在飛蝗翅發育中的功能，以期為漸變態昆蟲翅發育機制研究提供理論依據，同時為蝗蟲防治尋找新分子靶標，從而為蝗災生物防治提供基礎資料。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　試驗所用飛蝗蟲卵保存于本實驗室的昆蟲飼養室，于人工孵化箱中孵化后移至干凈的紗籠中，每天喂食新鮮的小麥幼苗(3 齡后輔以麥麩)，待其生長至 5 齡后進行試驗。培養溫度為(30±2)℃，濕度為(40±10)%。

　　1.2 相關試劑

　　RNA 提取試劑(RNAiso Plus)購于大連寶生物公司(TaKaRa);雙鏈 RNA 合成試劑盒購于 Promega 公司;膠回收試劑盒購于天根公司(TIANGEN);HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

　　1.3 cDNA 序列獲取及聚類分析

　　基于飛蝗轉錄組和基因組數據庫，搜索得到 LmNotch 基因的 cDNA 序列。將其 cDNA 序列翻譯成氨基酸序列，并對其編碼蛋白的功能域進行分析。下載人 Homo sapiens、小鼠 Mus musculus、黑腹果蠅 D. melanogaster、亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis、棉鈴蟲 Helicoverpa armigera、赤擬谷盜 T. castaneum、德國小蠊 Blattella germanica 等物種的 Notch 氨基酸序列，利用 MEGA 6.0 軟件的 Neighbor-Joining 方法構建系統進化樹，獨立分析 1000 次，數值代表 bootstrap 估算值。

　　1.4 總 RNA 的提取及表達特性分析

　　摘取 5 齡飛蝗第 1～8 d(N5D1-N5D8)的翅芽(WP)組織，同時取 5 齡第 6 d 的若蟲各個組織包括足(LG)、體壁(IN)、翅芽(WP)、脂肪體(FB)、前腸(FG)、中腸(MG)、后腸(HG)、胃盲囊(GC)、精巢(TE)、卵巢(OV)。利用 RNAiso Plus 提取總 RNA，最終定量至 0.5 μg/μL。根據反轉錄說明書進行反轉錄，得到 cDNA。通過 Primer Premier 5.0 軟件設計 LmNotch 基因的特異性熒光定量引物(表 1，由生工公司合成)，以 RPL-32 為內參基因，利用 qRT-PCR 的方法檢測 LmNotch 的時期和組織表達情況，設置 4 次重復試驗，結果用 2 -ΔΔCt 法進行分析[18]。

　　1.5 RNA 干擾和 H&E 染色

　　根據 LmNotch 的 cDNA 序列設計并合成帶有 T7 啟動子序列的特異性引物(表 1，由生工公司合成)，以 5 齡若蟲翅芽 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后利用膠回收試劑盒進行膠純化。以 1 μg 膠回收產物為模板利用 dsRNA 合成試劑盒合成 LmNotch 基因的 dsRNA(dsLmNotch)，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶后定量至 2 μg/μL。選取 24 h 內的 5 齡第 1 d 的飛蝗，對其注射 dsLmNotch(注射數量為 42 只)，每只的注射劑量為 10 μg，同時注射等量的 dsGFP(共 47 只)作為對照。取 5 齡第 6 d(N5D6)的飛蝗翅芽組織，一部分用于沉默效率檢測，檢測時取 6 組重復，每組設 2 次技術重復，另一部分用 3%戊二醛進行固定。同時摘取對照組和處理組蛻皮前(N5D7)的翅芽，用 3%戊二醛固定，隨后送往武漢塞維爾生物科技有限公司進行石蠟切片和 H&E(伊紅和蘇木精)染色。剩余蟲子正常飼養進行表型觀察。

　　1.6 LmNotch 對其他翅發育相關基因表達的影響

　　利用課題組飛蝗轉錄組數據庫，識別翅發育相關基因包括 Dpp、Omb(optomotor-blind)、 Salm(spalt major)、Salr(spalt related)、Yorkie 以及翅特異表皮蛋白基因 LmACP7、LmACP8、 LmACP19。分別以 RNA 干擾的處理組和對照組個體翅芽組織 cDNA 為模板，利用 qRT-PCR 檢測其他翅發育相關基因的表達，檢測引物見表 1(由生工公司合成)。

　　1.7 數據統計與分析

　　采用 2 -ΔΔCt 法對 LmNotch 基因在不同發育天數和不同組織中的相對表達量、RNA 干擾后 LmNotch 沉默效率、以及沉默 LmNotch 后翅發育相關基因的相對表達量進行分析，采用 Student t-test 方法進行差異表達分析(*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著)。

　　2 結果與分析

　　2.1 LmNotch 功能域及聚類分析

　　根據飛蝗轉錄組和基因組數據庫，搜索獲得 LmNotch 基因 cDNA 序列，該基因含有 7455 bp 開放閱讀框，編碼 2484 個氨基酸。通過對 LmNotch 基因編碼蛋白進行結構分析發現其含有 36 個 EGF(epidermal growth factor)重復單元、3 個 NL(Lin-12/Notch)結構域、1 個NOD(NOTCH protein domain)結構域、1 個 NODP 結構域、7 個 ANK(Ankyrin repeats)結構域和 1 個 DUF3454(Domain of unknown function)區域(圖 1A)。聚類分析顯示，Notch 在物種間保守性較高，且 LmNotch 與蜚蠊目 Notch 聚為一支(圖 1B)。

　　2.2 LmNotch 在 5 齡飛蝗中的表達特性

　　利用 qRT-PCR 進行 LmNotch 的表達特性檢測，結果顯示 LmNotch 在 5 齡若蟲翅芽發育第 1～4 d 的表達量較高(N5D1～N5D4)，而在第 5～8 d 表達量較低(N5D5～N5D8)(圖 2A);LmNotch 在足、翅芽、前腸和卵巢中有較高表達，而在其他組織中表達量相對較低(圖 2B)。

　　2.3 LmNotch 生物學功能分析

　　對 5 齡第 2 d 的飛蝗注射 dsLmNotch，以注射等量 dsGFP 的飛蝗為對照，取翅芽檢測沉默效率。結果顯示，相對于對照組，處理組中 LmNotch 表達極顯著降低(圖 3A)。表型觀察結果顯示，對照組飛蝗均能蛻皮至成蟲，而注射 dsLmNotch 的飛蝗約 70%無法完成蛻皮過程產生致死表型，另有 10%的飛蝗能夠蛻至成蟲但出現翅紊亂表型(圖 3B，3C)。分別對 N5D6 和 N5D7 的對照組和處理組飛蝗翅芽進行石蠟切片和 H&E 染色分析，結果顯示，對照組中 N5D6 和 N5D7 翅芽舊表皮發生降解，形成大量新表皮并產生折疊，上下兩層新表皮間形成空腔，而處理組中翅芽舊表皮雖能夠正常降解但翅上下兩層表皮之間腔空間增大，新表皮無法完整形成(圖 4)。

　　2.4 LmNotch 影響翅發育相關基因的表達

　　利用 qRT-PCR 檢測沉默 LmNotch 的表達后翅發育相關基因及翅特異表皮蛋白基因的表達，結果顯示 Dpp、Omb、LmACP7 和 LmACP8 基因的表達量顯著降低，而 Yorkie 和 LmACP19 的表達量顯著升高(圖 5)。

　　3 討論

　　本文基于飛蝗翅轉錄組數據庫，獲得了 Notch 信號通路中關鍵受體因子 Notch。與其他物種 Notch 類似，飛蝗 Notch 含有 EGF 重復單元、Lin-12/Notch 結構域、NOD/NODP 結構域和 ANK 結構域，且該蛋白在物種間高度保守(圖 1)，暗示其可能具有保守性功能。已有研究表明 Notch 在生物體的生長發育、器官形成中的細胞分化增殖和凋亡具有重要作用 [19]。如果蠅中，Notch 的重復單元 EGF-23 到 EGF-29 發生單個氨基酸替換時，導致果蠅 Notch 信號的異常從而發生表型變化[20]。在哺乳動物中，研究表明 Notch 信號通路對哺乳動物的神經系統和生殖系統等發育具有重要作用[21]。

　　在無脊椎動物中，昆蟲是唯一有翅的生物類群。昆蟲翅的發育受到一系列信號通路的控制，如 Hippo，Wingless，Dpp 和 Notch 等信號通路。在家蠶 Bombyx mori 中，干擾 Hippo 信號通路中轉錄共激活因子 BmYorkie3 的表達能夠抑制翅生長發育[22]。Dpp 信號通路靶基因 Sal(Salm 和 Salr)是飛蝗和果蠅翅生長發育所必需的[23]。在飛蝗中，LmNotch 在翅芽組織中高表達(圖 2)，可能參與飛蝗翅的發育。利用飛蝗對 RNA 干擾的敏感性，合成并向 5 齡若蟲注射 LmNotch 基因 dsRNA，結果顯示 LmNotch 沉默效率達到 90%以上，且沉默 LmNotch 的飛蝗個體出現蛻皮困難和翅紊亂的表型(圖 3)，表明 LmNotch 在飛蝗蛻皮和翅發育中發揮了重要作用，但 LmNotch 如何影響飛蝗蛻皮和翅發育尚不清楚。據報道，Notch 受體與配體 Delta (Dl)和/或 Serrate 結合后，會經歷一系列的蛋白水解，從而產生 Notch 胞內結構域(Notch intracellular domain，NICD)[24]。NICD 轉移到細胞核中，與轉錄因子 Hairless和協同激活因子 Mastermind 結合，刺激下游靶基因的表達[25]。為了探討 LmNotch 在飛蝗翅發育中的下游靶基因，作者根據果蠅翅發育相關基因序列(Dpp，Omb，Salm，Salr 和 Yorkie)搜索獲得了飛蝗同源基因序列并檢測了沉默 LmNotch 表達后翅發育相關基因的表達變化。結果發現，沉默 LmNotch 表達后 Dpp 和 Omb 表達顯著下降，Yorkie 表達顯著上升，而 Salm 和 Salr 沒有顯著變化(圖 5)。2014 年，Djiane 等[26]研究發現 Notch 能夠抑制果蠅翅原基中 Yorkie 的活性，這與本試驗結果一致。同樣在果蠅翅發育研究中，Dpp 對其下游基因 omb 起正調節的作用[27]，而在飛蝗中沉默 LmNotch 表達后能夠降低 Dpp 和 Omb 的表達。上述結果表明，LmNotch 能夠調控 Hippo 和 Dpp 信號通路中關鍵基因的表達進而影響翅的發育。

　　昆蟲翅的發育除了受一系列復雜的基因控制外，還依賴于細胞的一系列功能和細胞外基質。本課題組前期研究中發現飛蝗翅特異表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8 和 LmACP19)在翅表皮細胞外基質形成和穩定性方面發揮重要作用，這些基因的缺失可導致飛蝗翅發育異常[28-30]。本文研究發現，沉默 LmNotch 表達后能夠顯著抑制 LmACP7 和 LmACP8 的表達，而促進 LmACP19 的表達(圖 5)，這可能是導致翅表皮形成異常的原因之一(圖 4)，這些結果暗示 LmNotch 可能通過調控翅表皮蛋白基因的表達參與飛蝗翅表皮細胞外基質的形成，然而其具體作用機制如何，還需要進一步研究。