飛蝗Dpp基因在翅發(fā)育中的功能分析

　　摘要：Dpp(Decapentaplegic，Dpp)是脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中非常重要且高度保守的一個(gè)信號(hào)通路，在細(xì)胞的生長和分化等方面具有調(diào)控作用。在完全變態(tài)昆蟲中Dpp調(diào)控翅的生長發(fā)育，但對(duì)漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育的作用機(jī)制尚不清楚。本文以飛蝗為研究對(duì)象，根據(jù)同源性搜索識(shí)別飛蝗Dpp基因(LmDpp)，并對(duì)其編碼的氨基酸序列與不同昆蟲Dpp進(jìn)行多序列比對(duì)。然后，利用RT-qPCR方法對(duì)LmDpp在五齡飛蝗不同組織及不同發(fā)育天數(shù)的翅芽進(jìn)行表達(dá)特性分析，結(jié)果顯示LmDpp在五齡每天的翅芽組織中均有表達(dá)，且在多個(gè)組織中高表達(dá)。利用RNA干擾技術(shù)探討LmDpp在飛蝗翅發(fā)育中的作用，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射LmDpp基因的dsRNA(double-strandedRNA，dsRNA)的處理組約有31%的飛蝗在蛻皮后出現(xiàn)翅紊亂表型。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，H&E)染色結(jié)果表明，沉默LmDpp后的翅新表皮形成異常;RT-qPCR結(jié)果顯示，沉默LmDpp后導(dǎo)致飛蝗翅特異表皮蛋白基因LmACP7、LmACP8和LmACP19(Adultcuticleprotein，ACP)的表達(dá)量顯著降低。上述結(jié)果表明，LmDpp可能通過調(diào)控飛蝗翅特異表皮蛋白基因的表達(dá)參與翅的發(fā)育與形成，研究結(jié)果可為Dpp在漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育中的作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

　　武兆辰; 張福斌; 徐子龍; 張晶; 張建珍; 趙小明， 山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 發(fā)表時(shí)間：2021-09-17

　　關(guān)鍵詞：飛蝗;翅發(fā)育;Dpp;RNA干擾

　　0引言

　　昆蟲是無脊椎動(dòng)物中唯一有翅的動(dòng)物。飛行使得昆蟲在覓食、繁殖、遷移以及躲避敵害等方面占據(jù)很大的優(yōu)勢(shì)，這也是昆蟲種類和數(shù)量繁多的主要原因之一。昆蟲翅的生長發(fā)育受到多個(gè)信號(hào)通路以及一系列復(fù)雜基因的調(diào)控。

　　Decapentaplegic(Dpp)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族，是脊椎動(dòng)物骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenet?icprotein，BMP)的同源物，且在物種間具有保守性。Dpp在昆蟲生長發(fā)育的多種細(xì)胞和分子過程中發(fā)揮著多種作用，類似于生長分化因子(growthanddifferentiationfactors，GDFs)、激活素(Activin)和節(jié)點(diǎn)素(Nodal)[1]。目前，在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中對(duì)昆蟲Dpp基因功能研究最為深入。在果蠅胚胎發(fā)育的早期階段，Dpp主要參與胚胎間隔的形成和背腹軸的分化[2]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)Dpp與Hedgehog和Wingless信號(hào)通路協(xié)作，通過Dpp不同濃度梯度的存在，作為一種形態(tài)因子，決定了包括翅、足和觸角在內(nèi)的附著物的位置和分化[3-4]。此外，先前研究報(bào)道表明，Dpp在卵子發(fā)生中起重要作用，并與前端卵殼結(jié)構(gòu)形成模式有關(guān)[5]。Dpp還可以通過促進(jìn)視網(wǎng)膜下膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)來促進(jìn)眼睛的發(fā)育[6-7]。

　　關(guān)于Dpp在昆蟲翅發(fā)育中的研究同樣主要集中在黑腹果蠅，而在其他昆蟲中的研究報(bào)道較少。例如，在果蠅翅原基發(fā)育過程中，Dpp在前后腔室邊界中央條紋形成不同的濃度閾值，并以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)水平[8-9]。隨后，Dpp通過控制正在發(fā)育的翅中細(xì)胞的生長和增殖速率來決定最終的翅大小[9-10]。在果蠅中，Dpp沿翅脈高量表達(dá)，其功能的喪失導(dǎo)致脈序的部分缺失或不完全發(fā)育[11-12]。與果蠅類似，黃翅菜葉蜂(Athaliaro?sae)的Dpp基因在前翅和后翅均有廣泛表達(dá)，Dpp基因敲除導(dǎo)致翅脈發(fā)育完全缺失[13]。此外，Dpp還參與了小地老虎(Agrotisipsilon)翅芽的再生[14]。綜上所述，Dpp參與昆蟲翅發(fā)育進(jìn)程，在不同物種間其作用具有相似性，但作用方式略有不同。

　　飛蝗(Locustamigratoria)是一種不完全變態(tài)昆蟲，也是一種重要的作物害蟲，主要為害禾本科植物。目前，針對(duì)Dpp在昆蟲生長發(fā)育中的研究，尤其在翅發(fā)育中的研究，主要集中在以黑腹果蠅為代表的完全變態(tài)昆蟲中，然而Dpp在漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育中的作用機(jī)制尚不清楚。本文以飛蝗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索獲得Dpp基因cDNA序列，并進(jìn)行特征分析;通過RT-qPCR技術(shù)檢測LmDpp基因在5齡飛蝗若蟲中的時(shí)空表達(dá)模式，通過RNA干擾技術(shù)結(jié)合蘇木精-伊紅(Hematoxylineosin，H&E)染色分析LmDpp的生物學(xué)功能，為Dpp在漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育中的作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1實(shí)驗(yàn)材料

　　將保存于本實(shí)驗(yàn)室昆蟲飼養(yǎng)室的飛蝗蟲卵置于人工氣候箱中孵化，孵化后轉(zhuǎn)移至干凈的紗籠中，然后在溫度為(30±2)℃，濕度為(40±10)%的飼養(yǎng)室中用新鮮的小麥飼養(yǎng)，到達(dá)三齡后添加少許麥麩進(jìn)行飼養(yǎng)，長至五齡后進(jìn)行不同組織部位和不同發(fā)育天數(shù)翅芽取材以及其他實(shí)驗(yàn)。

　　1.2實(shí)驗(yàn)試劑

　　RNA提取試劑(RNAisoPlus)購于大連寶生物公司(TaKaRa);雙鏈RNA合成試劑盒購于Promega公司;ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix，HiScript?ⅢRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)購于南京諾唯贊生物科技有限公司;膠回收試劑盒購于天根公司(TIAN?GEN);其他相關(guān)試劑購置于生工生物工程(上海)股份有限公司(SangonBiotech)。

　　1.3實(shí)驗(yàn)方法

　　1.3.1飛蝗Dpp基因獲取及氨基酸序列比對(duì)

　　根據(jù)飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以黑腹果蠅Dpp基因(CG9885)cDNA序列進(jìn)行同源性搜索，獲得飛蝗Dpp基因(LmDpp)的cDNA序列。利用Translatetool(https：//web.expasy.org/translate/)將LmDppcDNA序列翻譯成氨基酸序列;在NCBI網(wǎng)站對(duì)LmDpp序列進(jìn)行BLAST分析并下載黑腹果蠅、德國小蠊(Blattellager?manica)、內(nèi)達(dá)華白蟻(Zootermopsisnevadensis)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、棉鈴蟲(Heli?coverpaarmigera)的Dpp氨基酸序列，利用GENEDOC軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。

　　1.3.2LmDpp表達(dá)特性檢測

　　摘取五齡若蟲飛蝗每一天(第1-8天，N5D1-N5D8)的翅芽(Wingpads，WP)組織，同時(shí)挑選發(fā)育整齊的五齡第6天的飛蝗，摘取其不同組織，包括足(Leg，LE)、體壁(Integu?ment，IN)、翅芽(WP)、脂肪體(Fatbody，F(xiàn)B)、前腸(Foregut，F(xiàn)G)、中腸(Midgut，MG)、后腸(Hindgut，HG)、胃盲囊(Gastriccaeca，GC)、精巢(Testis，TE)和卵巢(Ovary，OV)。利用RNAisoPlus提取不同組織和不同時(shí)期樣品的總RNA，并稀釋到0.5μg/μL。置于-80℃冰箱保存。接著按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書取1μL總RNA進(jìn)行cDNA的合成。再通過PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)LmDpp基因和RPL-32內(nèi)參基因的特異性熒光定量引物(表1，由上海生工公司合成)，利用RT-qPCR的方法檢測LmDpp在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，不同組織和發(fā)育時(shí)期均設(shè)置四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。最后LmDpp的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

　　1.3.3LmDpp基因雙鏈RNA合成及RNA干擾

　　根據(jù)LmDpp基因序列設(shè)計(jì)并合成含有T7啟動(dòng)子序列的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)引物(表1，上海生工公司合成)，以五齡飛蝗的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過膠回收回收目的條帶，并測定回收產(chǎn)物的濃度。取1μg的膠回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行dsRNA的合成，將合成的dsRNA定量到2μg/μL，接著瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，置于-20℃保存。選取五齡第1天飛蝗38頭，雌雄比例約為1：1，用微量注射器將Lm?DppdsRNA(dsLmDpp)注射于飛蝗體腔。每頭注射5μL，即10μg。再選取41頭飛蝗，注射等量的dsGFP作為對(duì)照組。分開飼養(yǎng)，分別喂食新鮮的小麥，飼養(yǎng)至五齡第6天分別取對(duì)照組和處理組飛蝗翅芽組織進(jìn)行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR方法檢測沉默效率。剩余飛蝗繼續(xù)飼養(yǎng)并進(jìn)行表型觀察。

　　1.3.4H&E染色及翅表皮蛋白基因表達(dá)檢測

　　根據(jù)1.3.3中RNAi結(jié)果，重復(fù)挑選五齡第1天的飛蝗分別注射dsLmDpp與dsGFP，新鮮小麥飼養(yǎng)，在蛻皮前(N5D7)各取對(duì)照組和處理組飛蝗翅芽組織，一部分提取RNA檢測沉默效率，另一部分3%戊二醛固定后送到武漢塞維爾生物公司進(jìn)行石蠟切片和蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，H&E)檢測。根據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ)，選取沉默效率顯著的3組處理組飛蝗，利用RT-qPCR檢測LmDpp沉默后對(duì)飛蝗翅特異表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8和LmACP19)表達(dá)的影響，以RPL32為內(nèi)參基因，每組設(shè)置兩個(gè)技術(shù)重復(fù)，檢測結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，引物如表1。

　　1.3.5數(shù)據(jù)分析

　　LmDpp基因在不同發(fā)育天數(shù)和不同組織中的表達(dá)、LmDpp沉默效率以及LmDpp沉默后翅表皮蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量均采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，并采用Studentt-test方法進(jìn)行差異表達(dá)分析(*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01和***P<0.001表示差異極顯著)。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1LmDpp序列比對(duì)分析

　　根據(jù)黑腹果蠅Dpp基因cDNA序列進(jìn)行同源搜索，識(shí)別了飛蝗LmDppcDNA序列，該基因編碼蛋白含有一個(gè)TGFβ_propeptide和TGFβ結(jié)構(gòu)域，多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)TGFβ_propeptide在物種間保守性較低，而TGFβ結(jié)構(gòu)域相似性較高(圖1)。

　　2.2LmDpp在五齡不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

　　利用RT-qPCR檢測LmDpp在五齡飛蝗不同發(fā)育天數(shù)翅芽組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Lm?Dpp在第1天到第8天都有較高的表達(dá)量(N5D1-N5D8);不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，LmDpp在多個(gè)組織中都有表達(dá)，如足、體壁、翅芽、脂肪體、前腸、后腸、精巢、卵巢，其中Lm?Dpp在足、體壁、前腸中高表達(dá)(圖2)。

　　2.3LmDpp在飛蝗中的生物學(xué)功能分析

　　選取五齡第1天的飛蝗進(jìn)行dsLmDpp的注射，同時(shí)注射等量的dsGFP作為對(duì)照。繼續(xù)飼養(yǎng)至第6天，取飛蝗翅芽提取總RNA，RT-qP?CR檢測LmDpp的沉默效率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射dsLmDpp的處理組飛蝗中Lm?Dpp表達(dá)量極顯著下降(圖3A)，沉默效率達(dá)到77.8%。對(duì)飛蝗的表型進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，對(duì)照組飛蝗均能正常蛻皮至成蟲，注射dsLmDpp的飛蝗雖能夠成功蛻皮但約有31%的成蟲出現(xiàn)翅型紊亂的表型，具體表現(xiàn)為前后翅無法正常閉合、皺縮卷曲(圖3B)。

　　2.4LmDpp影響飛蝗翅表皮發(fā)育

　　為了進(jìn)一步探討LmDpp如何影響飛蝗翅發(fā)育，在沉默LmDpp表達(dá)后，摘取蛻皮前(N5D7)翅芽組織進(jìn)行石蠟切片和H&E染色分析，以注射dsGFP的飛蝗翅芽為對(duì)照。H&E染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中蛻皮前翅芽舊表皮發(fā)生降解，形成大量新表皮并產(chǎn)生折疊，上下兩層新表皮間形成空腔，蛻皮后發(fā)育成成蟲翅膜和翅脈，而處理組中翅芽舊表皮正常降解，翅新表皮能夠折疊但形成異常、無法正常排列形成空腔和正常表皮結(jié)構(gòu)(圖4A，B);通過RT-qPCR技術(shù)檢測飛蝗翅表皮蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組中LmACP7、LmACP8和LmACP19的表達(dá)顯著下降(圖4C)。

　　3討論

　　昆蟲翅形態(tài)的多樣性是昆蟲種群生長發(fā)育的重要原因之一。Dpp信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化等。在完全變態(tài)昆蟲果蠅中，Dpp在胚胎發(fā)育和成蟲附肢的形成中起著成形素(morphagen)的作用。如在翅成蟲盤中，通過DPP濃度梯度依賴的方式誘導(dǎo)不同基因的區(qū)域表達(dá)來控制前、后成蟲盤的形成[15]。另外，在果蠅背板愈合中線處抑制Dpp信號(hào)通路的受體或其信號(hào)因子均可以引起嚴(yán)重的背板愈合缺陷現(xiàn)象[16]。近年來，大量研究表明，Dpp基因可以在各種昆蟲的翅發(fā)育中發(fā)揮相同、相似甚至不同的作用，這可能與昆蟲發(fā)育方式相關(guān)。

　　飛蝗是典型的漸變態(tài)昆蟲，翅在其遷飛、覓食和躲避敵害等方面具有重要作用。本文根據(jù)黑腹果蠅Dpp基因編碼序列，基于飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過同源搜索獲得飛蝗Dpp基因編碼序列。與其他昆蟲類似，LmDpp基因編碼蛋白含有一個(gè)TGFβ_propeptide和TGFβ結(jié)構(gòu)域，其中TGFβ結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與完全變態(tài)昆蟲(如黑腹果蠅、棉鈴蟲、亞洲玉米螟等)相似性較高(圖1)，暗示其功能具有保守性。在漸變態(tài)昆蟲褐飛虱(Nilaparvatalu?gens)翅發(fā)育過程中，NlDpp主要負(fù)責(zé)翅脈的形成，NlDpp的沉默導(dǎo)致長翅型和短翅型褐飛虱前翅和后翅的翅脈完全消失[17]，這種表型與在黃翅菜葉蜂中沉默Dpp的表型相同[13]。在果蠅翅中過表達(dá)Dpp導(dǎo)致額外翅脈的發(fā)育[18]，而Dpp的缺失導(dǎo)致翅脈的部分喪失[11-12]。上述結(jié)果表明，Dpp可能在一定程度上保留了其在昆蟲翅脈發(fā)育中的功能。昆蟲翅由翅脈和翅膜構(gòu)成，其來源于外胚層，具有表皮結(jié)構(gòu)。在飛蝗中，沉默LmDpp后導(dǎo)致飛蝗翅發(fā)育異常，翅表現(xiàn)出卷曲、皺縮的表型(圖3)。H&E染色結(jié)果顯示，沉默LmDpp后飛蝗翅表皮發(fā)育異常，新表皮無法正常形成(圖4A，B)，表明LmDpp在飛蝗翅表皮形成中具有重要作用。飛蝗五齡若蟲新形成的表皮蛻皮后將發(fā)育成成蟲翅(由翅脈和翅膜構(gòu)成)，沉默LmDpp影響上下兩層新表皮間空腔的正常形成，可能導(dǎo)致成蟲翅脈和翅膜無法正常形成，進(jìn)而導(dǎo)致成蟲翅出現(xiàn)皺縮卷曲現(xiàn)象。

　　在褐飛虱中，RNAi介導(dǎo)的NlDpp表達(dá)沉默可以顯著改變多個(gè)翅發(fā)育基因的表達(dá)[17]，表明在Dpp調(diào)控翅形成的過程中，需要多個(gè)下游基因協(xié)同參與。例如，Dpp信號(hào)通路可以調(diào)控Spaltmain(Salm)和Spalt-Related(SalR)編碼的鋅指轉(zhuǎn)錄因子控制果蠅翅成蟲盤的形成[19]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，表皮蛋白基因LmACP7，LmACP8和LmACP19在飛蝗翅中特異表達(dá)[20]，其中LmACP7的表達(dá)缺失引起翅表皮細(xì)胞排列發(fā)生紊亂、細(xì)胞連接被破壞，從而引發(fā)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21];而RNA干擾另一個(gè)翅表皮蛋白基因LmACP8的表達(dá)量，導(dǎo)致飛蝗從若蟲到成蟲的翅形態(tài)發(fā)生異常[22]。本文中干擾LmDpp的表達(dá)引起LmACP7，LmACP8和LmACP19的表達(dá)顯著下降(圖4C)，結(jié)果表明LmDpp可能通過調(diào)控飛蝗翅表皮蛋白基因的表達(dá)進(jìn)而控制翅表皮的形成。然而，LmDpp基因如何調(diào)控下游靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)而控制翅發(fā)育需要進(jìn)一步研究。本文研究結(jié)果為Dpp基因在漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育中的具體作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。