丁氟螨酯在蚯蚓體內的富集及其急性毒性

　　摘 要：丁氟螨酯(CYF)對土壤中非靶標動物蚯蚓的影響尚未明確。本研究建立了丁氟螨酯在蚯蚓體內的檢測方法。樣品經乙腈提取，采用液液萃取法去除蚯蚓體內的油脂，利用正相液相色譜(NP-HPLC)進行檢測。結果表明：在 0.5、5 和 10 mg/kg 3 個添加水平下，CYF 在蚯蚓中的回收率在 84%~88%之間，相對標準偏差在 1.3%~3.1%之間，上述結果驗證了該提取方法的可靠性。生物-土壤富集因子(BSAF)表明，蚯蚓富集 CYF 7d 后兩個對映體在蚯蚓體內的富集濃度達到最大值，且(+)-CYF 的富集能力顯著高于(-)-CYF 的。蚯蚓在 0.5~10 mg/kg CYF 的土壤中暴露 28d 時會嚴重抑制其體重。通過濾紙法檢測到 CYF 對蚯蚓的急性毒性，CYF 消旋體對蚯蚓的 LC50 值為 162.5 mg/L，(-)-CYF 對蚯蚓的 LC50 值為 323.1 mg/L，(+)-CYF 對蚯蚓的 LC50 值為 309.4 mg/L。根據聯合毒性效應分析得到 AI=-0.03，同時使用 CYF 的兩個對映體會對蚯蚓造成毒性相加作用。

　　石琳琳; 楊燦燦; 陳琪; 徐軍; 張平; 何林， 農藥學學報 發表時間：2021-09-26

　　關鍵詞：丁氟螨酯;蚯蚓;生物-土壤富集因子;體重;急性毒性

　　丁氟螨酯(CYF)是一種使用廣泛的新型手性高效殺螨劑，它可以有效防控紅蜘蛛的各個生長階段，已經在全世界范圍內商業化并用于多種農作物[1]。目前，關于丁氟螨酯的研究主要集中在土壤中的降解和代謝途徑的建立以及對靶標生物的毒理學方面[2]。大量研究結果表明，丁氟螨酯在環境和細胞中存在一定的風險性[2]。不合理使用會造成土壤中 CYF 的沉積量不斷增加。農藥對土壤環境影響的評估，主要通過對土壤系統中微生物的影響以及對土壤中非靶標生物的毒性研究進行。據報道，丁氟螨酯對映體會影響土壤微生物的結構，甚至會破壞原有的土壤氮循環功能，最終對生態環境造成負面影響[3]。而丁氟螨酯在土壤中對非靶標生物的毒理學研究未見文獻報道。

　　蚯蚓作為土壤中的主要非靶標動物對土壤富集營養和對有機物、無機物的分解有著極其重要的作用[4]。蚯蚓可以分解土壤中死去的有機物，同時也是許多物種的重要食物來源[5]。由于蚯蚓對農藥的刺激十分敏感，通常被作為土壤污染的最為敏感的生物標志物[6]。鑒于此，本研究通過丁氟螨酯在蚯蚓體內富集能力以及對其體重的影響，來評估其環境風險，以期為更好地評價新型乙腈類殺螨劑-丁氟螨酯提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 供試材料與儀器

　　98%丁氟螨酯消旋體(Rac-CYF)購于北京華威銳科公司，(-)-CYF 和(+)-CYF 于本實驗室分離得到，純度亦均為 98%。分析純乙醇、正己烷、異丙醇、1%乙酸、丙酮、無水硫酸鈉和氯化鈉購于 Amida Chemical Co.，Ltd;0.22 μm 濾膜購于西南大學文化用品百貨公司。其他試劑均為分析純或 HPLC 級。供試蚯蚓為赤子愛勝(Eisenia fetida)購于青島瓦力生物科技有限公司。蚯蚓暴露在土壤之前，于(20±2)℃、相對濕度 80%條件下適應環境 2 周。挑選體重[(0.4±0.02)g]均勻的帶有生殖環的蚯蚓，置于濾紙上進行 12h 的清腸處理。試驗用土為人工土，由 70%沙土、20%高嶺土和 10%泥炭蘚(質量分數)組成，用碳酸鈣調整 pH 值為 6.0±0.5，完全符合經合組織(OECD)人工土配制標準[7]。

　　Shimadzu LC-20AD 正相液相色譜儀(日本 Shimadzu 公司);高速組織搗碎機(上海齊欣科學儀器有限公司);ZWY-240 恒溫培養振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司);RE52AA 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器公司);3-5N 臺式低速離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)。

　　1.2 丁氟螨酯對映體在蚯蚓體內富集情況檢測

　　向已配制好的人工土中添加 CYF，添加水平為 10 mg/kg 的 CYF 外消旋，其兩個等量對映體的濃度為 5 mg/kg，將蚯蚓暴露于污染土壤中。分別于處理后 2、4、7、9、12、14 和 21d 取樣檢測對映體在蚯蚓體內富集情況。按公式(1)計算生物-土壤富集因子[8]。 BSAF =ce/cs (1)式中，BSAF 為蚯蚓從土壤中富集污染物的能力;ce 為蚯蚓體內對映體濃度;cs 為土壤中對映體濃度。

　　1.3 蚯蚓中丁氟螨酯的提取及檢測

　　丁氟螨酯在蚯蚓中的提取，以乙腈為提取溶液，使用 Shimadzu LC-20AD 的 NP-HPLC 進行檢測。取已染毒的蚯蚓 5 g，過夜吐泥后，放入 50 mL 離心管中，加入 25 mL 乙腈，用高速組織搗碎機勻漿 30 s;加入 2 g 氯化鈉、2 g 硫酸鈉和 10 mL 去離子水，于 300 r/min 下振蕩 30 min 后，于 4500 r/min 下離心 15 min;取上清液，過無水硫酸鈉后轉移至梨形蒸發瓶，反復進行 3 次提取;收集全部提取液，旋轉蒸發至 1 mL，加入 1 mL 正己烷進行分層萃取。同樣步驟進行 3 次;取上清液，于 40℃下旋轉蒸發至近干，用正己烷定容至 1 mL，過 0.22 μm 濾膜，待 NP-HPLC 測定。

　　檢測對映體拆分的手性分離柱選用 AY-H 柱，流動相 V(正己烷)：V(異丙醇)=97:3 溶液，柱流量為 0.8 mL/min，進樣量為 10 μL。每個樣品 3 次重復。

　　1.4 添加回收試驗

　　向蚯蚓空白樣品中準確添加 0.5、5 和 10 mg/kg 3 個水平的丁氟螨酯標準溶液，每個水平重復 5 次。采用 1.3 節方法進行樣品前處理，采用 NP-HPLC 系統進行檢測，計算平均添加回收率和相對標準偏差(RSD)。根據一級反應動力學擬合效果、添加回收率、檢出限來驗證該方法的可行性[3]。

　　1.5 對 CYF 暴露的蚯蚓體重檢測

　　挑選體重為(0.5±0.1)g 的蚯蚓，分別放入 CYF 質量濃度為 0.5、5 和 10 mg/L 的人工土壤中，記錄各濃度暴露下蚯蚓的體重變化。選擇 7 條蚯蚓記錄其初始體重 W0，分別在暴露 4、7、14、21 和 28d 后記錄蚯蚓體重為 Wd，根據公式(2)計算體重的變化率 R。暴露結束后，用 1mm 網篩篩分培養的土壤，收集蚯蚓繭和蚯蚓幼體。每個處理重復 3 次。 R/%=(Wd-W0)/W0×100 (2)

　　1.6 急性毒性試驗

　　采用濾紙法和人工土壤法兩種方法進行。

　　1.6.1 濾紙法

　　根據 OECD 標準[7]，在直徑 3 cm、高 8 cm 的圓底玻璃管中，鋪好濾紙以確保沒有重疊，分別加入 1 mL 用正己烷配制的濃度分別為 50、100、150、200、300、500、700 和 1000 mg/L 的丁氟螨酯消旋體和對映體標準溶液，待正己烷完全揮發后，用 1 mL 無菌水均勻潤濕濾紙，放入一條已清腸的蚯蚓，確保蚯蚓可以接觸到濕潤的濾紙，每組 10 次重復。另以只加 1 mL 正己烷和 1 mL 水為空白對照。將玻璃管封口并保持透氣，于 18℃、相對濕度 80%條件下培養 48 h，觀察死亡情況。

　　根據 Marking 相加指數法[8]按公式(3)~(5)評價兩個對映體對蚯蚓的復合毒性。 s =