基于網絡藥理學及實驗驗證探討“山慈菇-漏蘆”藥對治療乳腺癌作用機制

　　[摘要] 目的：應用網絡藥理學的研究方法篩選“山慈菇-漏蘆”藥對治療乳腺癌的作用靶點及相關信號通路，通過體外實驗明確其作用機制。方法：通過運用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)數據庫檢索獲取“山慈菇-漏蘆”的主要化學成分以及相關作用靶點;使用 GendCards 篩選乳腺癌疾病的相關靶標基因;通過 Venn 軟件篩選出藥物與疾病的共同作用靶點;構建出藥物-疾病的靶點網絡;蛋白質-蛋白質相互作用網絡(PPI)的構建;通過基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析對有效作用靶點進行分析;通過細胞增殖與活性檢測(CCK-8)實驗、流式細胞術檢測細胞凋亡實驗、蛋白質免疫印跡法(Western blot)實驗進行進一步的實驗驗證。結果：通過篩選得到“山慈菇-漏蘆”有效化學成份 7 個，有效作用靶點 61 個，其中作用于乳腺癌的相關靶點 55 個。通過 GO 富集分析共富集到條目 832 個，在生物學過程方面集中體現。 KEGG 通路富集分析共富集到 85 個條目，包括腫瘤抑制基因信號通路 p53，血管內皮生長因子(VEGF)信號通路，人表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號通路等信號通路。通過體外實驗驗證了“山慈菇-漏蘆”醇提取物可抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞增殖，并誘導了細胞的凋亡，與空白組，二甲基亞砜(DMSO)組(0.1% 溶劑組)相比較，給藥組 MDA-MB-231 細胞吸光度顯著降低(P<0.01)，凋亡率顯著增高(P<0.01)，Western blot 實驗結果表示，與空白組和 DMSO 組相比較，各給藥組細胞中磷酸化(p)-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值均明顯降低(P<0.05)。結論： “山慈菇-漏蘆”醇提取物能有效抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞增殖，并可以誘導其凋亡，作用機制可能與抑制 PI3K/Akt 信號通路活化相關。

　　[關鍵詞] 網絡藥理學;乳腺癌;山慈菇;漏蘆;作用機制

　　王冰; 王玥; 朱仲康; 崔勇; 于嵩; 劉海興; 王旭， 中國實驗方劑學雜志 發表時間：2021-11-03

　　乳腺癌是女性發病率較高的惡性腫瘤之一，有相關報告指出，2018 年全球女性乳腺癌的發病率為每 10 萬人 46.3 人，死亡為 13.0 人，近年來呈顯著上升的趨勢[1]。有相關研究指出[2]，不同分子分型的乳腺癌中，與非三陰型乳腺癌相比較，其中三陰型乳腺癌的復發及內臟的轉移率均較高，并且生存率較低，預后較差，是影響患者預后的獨立危險因素。而對于此類型乳腺癌的治療，采用化療易發生耐藥，并且缺少內分泌治療靶點[3]。近年來，有研究表示[4]，中醫藥治療乳腺癌也取得了明顯的效果，并且越來越多的患者都在逐步積極接受中醫藥的治療。有實驗研究發現，山慈菇和漏蘆兩藥均有通過影響細胞增殖、凋亡以及細胞侵襲等多個方面來達到抗乳腺癌的作用[5-7]。李秀榮教授在治療乳腺癌藥對經驗總結中提到，山慈菇、漏蘆兩藥配伍具有明顯清熱解毒、散結抗癌的功效，并提出兩藥配伍在臨床上有顯著抗乳腺癌的功效[8]。在臨床應用中，散結類藥物在抗乳腺癌方面效果顯著，比如臨床常用制劑乳核散結片，該制劑中的主要成分山慈菇、漏蘆被廣泛應用在抗乳腺癌治療的方劑配伍當中，并有顯著的效果。但目前對兩藥聯合作用并且從細胞和分子水平來系統地闡述其抗乳腺癌的作用機制的研究較少，因此本研究通過網絡藥理學的研究方法篩選出“山慈菇-漏蘆” 藥對的有效成分，進一步構建“藥物-疾病”靶點的網絡圖，并探討該藥對抗乳腺癌的相關作用機制。

　　1 資料與方法

　　1.1 藥物關鍵化合物的篩選

　　運用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)檢索出山慈菇、漏蘆的主要有效化學成分，再對兩藥的化學成分進行口服利用度(OB)以及藥物相似性(DL)篩選，設置篩選條件為 OB≥30%，DL≥18%。

　　1.2 山慈菇、漏蘆化合物關鍵靶點及乳腺癌靶點的篩選

　　利用 TCMSP 檢索山慈菇、漏蘆化合物的關鍵作用靶標基因，利用 UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org/)檢索出靶標基因對應人類基因的名稱。乳腺癌相關疾病的靶標基因通過 GeenCards 數據庫檢索獲得。

　　1.3 構建“藥物-疾病”靶點網絡及可視化分析

　　利用 Venn 在線軟件選取藥物與疾病共同靶點，并繪制 Venn 圖，利用 Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化分析。

　　1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

　　將篩選得到的藥物-疾病共同靶點基因導入 STRING 數據庫，得到 PPI 網絡，進一步篩選出靶點基因。

　　1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

　　將“山慈菇-漏蘆”的靶蛋白上傳到 DAVID 6.8 數據庫，通過分析了解“山慈菇-漏蘆”藥對的有效成分對于乳腺癌的 GO 功能，進行 KEGG 通路分析找到相關靶標在通路中的分布情況，直接觀察到“山慈菇-漏蘆”藥對作用于乳腺癌的主要機制途徑。

　　2 實驗驗證

　　2.1 材料

　　人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

　　山慈菇、漏蘆中藥飲片[天馬(安徽)國藥科技股份有限公司];胎牛血清(FBS)(Clark 公司，批號 FB15015，);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen 公司，批號 25200056);DMEM 培養液(Hyclone 公司，批號 SH30022.01B);細胞增殖與活性檢測(CCK)-8 試劑盒(Solution Vazyme 公司，批號 A311-01);二甲基亞砜(DMSO，美國 Sigma 公司，批號 D2650);Annex in V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(美國 Everbright Inc 公司，批號 40302ES20，);BCA 法蛋白定量試劑盒(碧云天生物科技公司，批號 P0012);兔抗人磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)，磷酸化(p)-PI3K，蛋白激酶 B(Akt)，p-AKT(美國 Cell Signaling Technology 公司，批號分別為 ABP50495，ABP59902，4691S，4060S)。

　　AVC-4D1 型超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司);HERAcell 150i 型高溫滅菌二氧化碳培養(美國 Thermo 公司);ELX-800 型酶標儀(美國 BioTek 公司);ARIA Ⅲ型流式細胞儀(美國 BD 公司);WD-9413B 凝膠成像分析系統(北京六一制造廠);DYY-7C 型蛋白電泳儀(北京六一制造廠)。

　　2.2 方法

　　2.2.1 “山慈菇-漏蘆”醇提取物制備

　　稱取山慈菇 12 g，漏蘆 30 g，用粉碎機粉碎，加入 75%乙醇 500 mL，回流提取 3 次，均在沸后提取 1.5 h 左右，合并 3 次提取液，采用旋轉蒸發儀將提取液濃縮成浸膏狀，置于烘箱中 60 ℃烘干至粉末狀，置于 4 ℃ 冰箱備用。實驗開始前，首先將藥物用 DMSO 進行溶解并震蕩，配置成含生藥質量濃度為 10 g·L-1 的母液， DMEM 培養基稀釋為工作液，0.22 μm 濾膜除菌，備用。

　　2.2.2 MDA-MB-231 細胞培養

　　將人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞株置于 37 ℃，5% CO2 培養箱中，并使用 DMEM 高糖培養基(含 10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素)培養細胞，平均 1~2 d 進行 1 次換液，并取對數生長期細胞進行實驗。

　　2.2.3 CCK-8 法檢測細胞活性

　　取對數生長期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞消化，接種于 96 孔板，平均細胞數為 8×103 個/孔，設定實驗分組，分別為空白組，DMSO 組，低劑量組(10 mg·L-1)，中劑量組(25 mg·L-1)，高劑量組(50 mg·L-1)，將低、中、高劑量組的“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細胞 24 h，將培養液吸出后加入含 10%CCK-8 的培養基，2 h 后(避光孵育)，使用酶標儀在 450 nm 波長處檢測各組吸光度 A 并計算，細胞活性= (A 加藥細胞-A 空白)/(ADMSO-A 空白)×100%。

　　2.2.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡率

　　取對數生長期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞消化，接種于 6 孔板中，細胞數目約 1×105 個/孔，設定實驗分組，分別為空白組，DMSO 組，低、中、高劑量組，將低、中、高劑量組“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細胞 24 h，收集細胞后，每組加入的 Binding-Buffer 懸浮液 500 μL，依次加入 Annexin V-FITC 5 μL，Propidium Iodide 5 μL 進行混勻，染色 15 min(室溫避光)，于 1 h 內通過流式細胞儀檢測，并分析細胞的凋亡率情況。

　　2.2.5 應用蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測 PI3K，p-PI3K，Akt，P-Akt 蛋白的表達情況

　　取對數生長期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞消化，接種在 10.0 mm 直徑的培養皿中，每皿中平均細胞數量為 2×106 個，設定實驗分組，分別為空白組，DMSO 組，低、中、高劑量組，將低、中、高劑量“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細胞 24 h 后收集細胞，加上 RIPA 裂解液裂解細胞(冰上操作)，離心，收集蛋白進行蛋白濃度測定;取等量總蛋白上樣進行 15% SDS-PAGE，電泳條件為緩沖膠 110 V 電泳 30 min，分離膠 55 V 電泳 60 min，轉膜條件為 PVDF 膜 55 mA 恒流濕轉 120 min，封閉 60 min，PI3K，p-PI3K，Akt， P-Akt 一抗 4 ℃過夜孵育，次日滴加二抗避光室溫孵育 1 h 后 TBST 洗膜，ECL 發光后進行圖像采集及數據分析。

　　2.3 統計學方法

　　以上實驗重復 3 次，實驗數據采用 SPSS 22.0 進行統計學分析，數據???±s 表示，以 P<0.05 為差異有統計學意義。

　　3 結果

　　3.1 “山慈菇-漏蘆”藥物有效化學成分

　　本研究基于 OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，從 TCMSP 數據庫中共獲取 7 個有效化學成分，山慈菇 3 個，漏蘆為 5 個，其中 β-谷甾醇在兩藥中均含有。見表 1。

　　3.2 藥物與乳腺癌相關靶點

　　利用 GeneCards 數據庫篩選獲得乳腺癌相關靶共 14 630 個，將“山慈菇-漏蘆”的活性化合物對應的 61 個藥物靶點與乳腺癌對應的 14 630 個疾病靶點獲取交集，通過 Venn 圖的形式得到 55 個共同靶點。

　　3.3 “藥物-疾病”靶點網絡構建與分析

　　將 7 個有效成分及 55 個共同靶點通過 Cytoscape 3.7.2 軟件構建山慈菇-漏蘆“藥物-疾病”的可視化網絡圖。

　　3.4 藥物與乳腺癌靶蛋白 PPI 網絡的構建

　　從 Venn 圖中獲得 55 個藥物-疾病共同靶點上傳至 STRING 數據庫進一步得到 PPI 網絡。

　　3.5 “山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的通路富集分析

　　3.5.1 GO 通路富集分析

　　通過 GO 功能富集分析共獲得 832 個條目，其中“山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的關鍵靶點基因信息功能主要涉及的生物過程有細胞對藥物的反應(cellular response to drug)，膜電位的調節(regulation of membrane potential)，對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)，腺苷酸環化酶調節 G 蛋白偶聯受體信號通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)等。

　　3.5.2 KEGG 通路富集分析

　　通過分析共富集到 KEGG 通路 85 條，篩選功能排名前 21 名條目，“山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的關鍵基因靶點所涉及到的信號通路主要有雌激素信號通路，p53 信號通路，血管內皮生長因子(VEGF)信號通路，磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號通路，人表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，鈣信號通路，乳腺癌等經典信號通路，見表 2。

　　3.5.3 “山慈菇-漏蘆”醇提取物影響人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞增殖情況

　　與空白組，DMSO 組細胞相比，低、中、高劑量的“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用于乳腺癌 MDA-MB-231 細胞 24 h 后，3 組細胞活性顯著降低(P<0.01)，見表 3。

　　3.5.4 “山慈菇-漏蘆”醇提取物影響人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡情況

　　流式細胞儀檢測結果顯示，“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細胞 24 h 后，與空白組，DMSO 組比較，低、中、高劑量組的細胞凋亡率均顯著升高(P<0.01)。(表 4，圖 6)

　　3.5.5 “山慈菇-漏蘆”醇提取物對各組細胞中 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值的影響

　　Western blot 實驗的結果發現，“山慈菇-漏蘆”醇提取物在作用 MDA-MB-231 細胞 24 h 后，通過與空白組， DMSO 組比較，低、中、高劑量組細胞中的 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 的比值均顯著降低均明顯降低(P<0.05)。見表 5，圖 1。

　　4 討論

　　我國女性惡性腫瘤當中發病率最高的是乳腺癌，并且患者的死亡率也是逐年增加[9]。而在乳腺癌的分型當中，三陰型乳腺癌的死亡率占比最高，并且易復發轉移，在臨床治療中也是最棘手的，激素以及靶向治療對三陰性乳腺癌的效果均不顯著，幾乎只能通過化療進行診治[10]。此外，中醫講痰濁、熱毒等病理產物進行相互搏結而產生“癌毒”之邪，它可以是此類型乳腺癌的病因之一，可以采用清解癌毒、通絡化痰散結的治療方法進行治療。

　　有研究表明山慈菇、漏蘆治療乳腺癌可以取得很好的療效[11]，山慈菇性甘、涼、微辛，歸肝、脾經，具有清熱解毒，消癰散結之功，有實驗研究表明[12-13]，山慈菇提取液可以明顯抑制人乳腺癌 MDA?MB?231 細胞的增殖，還誘導其細胞的凋亡，作用機制可能是抑制了 PI3K/Akt 信號通路的活化;山慈菇水煎劑也可以明顯抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞增殖，誘導癌細胞的凋亡，抑制癌細胞的遷移。漏蘆苦寒，歸胃經，有清熱解毒、消癰散結、通經下乳、舒筋通脈的功效，有研究發現[14]，大劑量的漏蘆提取物可以發揮顯著的抑癌作用。因此兩藥配伍，具有明顯的清熱解毒、散結抗癌之功，是治療乳巖的要藥。

　　本研究結果發現，山慈菇、漏蘆治療乳腺癌中的有效化學成分主要有 β-谷甾醇，豆甾醇，2-甲氧基-9， 10-二氫菲-4、5-二醇，DFV，谷甾醇，甘草苷和地黃素 B。有研究報道顯示[15-16]，β-谷甾醇對肺癌、乳腺癌等有顯著作用，可以通過多種途徑發揮作用，比如細胞增殖、凋亡、周期、侵襲血管生成等。豆甾醇是一種生物活性高的天然提取物，生理功能較多，可以從抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、阻滯腫瘤細胞周期、破壞腫瘤血管生成、抑制癌細胞轉移等多種途徑發揮對肝癌、胃癌、膽管癌的抑癌作用 [17-19]。研究結果顯示了山慈菇，漏蘆兩藥中含有的相同或不同的化合物均具有顯著的抑癌作用，因此兩藥聯合應用可以得到更加顯著的抑癌效果。

　　通過 PPI 蛋白互作結果可以看出，經篩選得到的主要靶點有 GSK3B，ESR1，CASP8 以及 MAPK14 等。 ESR1(estrogen receptor 1)為編碼 ERα 的基因，該基因若出現突變，常會導致乳腺癌內分泌治療的耐藥，因此對該基因的監測對乳腺癌治療以及預后會發揮很大的作用[20]。GSK3B(Glycogen synthase kinase-3 beta)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以通過作用信號蛋白結構蛋白以及轉錄因子來調控細胞的增殖、分化以及凋亡等。有研究發表明[21]，GSK3B 的表達情況影響著胃癌預后的情況。半胱氨酸蛋白酶 CASP8 是一種促凋亡蛋白，參與外源性凋亡信號通路，因此，其作為一種抑癌基因，參與了諸多腫瘤的發病過程，比如肝癌[22-23]、前列腺癌[24]等。MAPK14 作為 MAPK 亞家族成員之一，通過影響腫瘤細胞的凋亡與周期等生物學特性來影響腫瘤的發生發展，CHEN[25]等研究表明通過 MAPK14 來抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞的轉移。由此可見，以上基因都參與著腫瘤的發生發展過程，并影響腫瘤的預后。

　　本研究通過 GO 富集分析結果發現，“山慈菇-漏蘆”抗乳腺癌的靶基因主要是通過影響細胞對藥物的反應、膜電位的調節、對類固醇激素的反應、腺苷酸環化酶調節 G 蛋白偶聯受體信號通路等生物學功能而達到抗乳腺癌的目的。在本研究 KEGG 富集分析的結果中發現，“山慈菇-漏蘆”主要是通過雌激素信號通路， p53 信號通路，PI3K-Akt 信號通路等發揮抗乳腺癌的作用。雌激素信號通路可以與一些蛋白互作，可能會同 TGF-β，MAPK，Akt，NF-κB 等信號傳導途徑交互，最終對乳腺腫瘤細胞的增殖、轉移等具有影響[26]。p53 是一種抑癌基因，當細胞癌變時，上游功能的相關基因來抑制體內 p53 的表達，進而抑制細胞周期阻滯以及凋亡。在惡性腫瘤的發生發展中，PI3K/Akt 信號通路發揮著重要作用，有研究結果發現 PI3K/Akt 信號通路對惡性腫瘤的侵襲和轉移等方面具有重要調控作用[27-28]，本研究選擇此信號通路進行實驗驗證，發現“山慈菇 -漏蘆”醇提取物可能是通過抑制 PI3K/Akt 信號通路的激活對人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞增殖起到抑制作用并促進其細胞的凋亡。

　　本研究最后對網絡藥理學所分析的結果進行了體外實驗驗證，通過“山慈菇-漏蘆”醇提取物對人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞的增殖、凋亡以及對 PI3K/Akt 信號通路的調控作用進行實驗研究。實驗結果發現“山慈菇 -漏蘆”醇提取物可以對人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞的增殖有抑制作用，并且可以誘導人乳腺癌 MDA-MB-231 細胞的凋亡，通過抑制 PI3K/Akt 信號通路活化進而控制乳腺癌發展。

　　綜上可見，“山慈菇-漏蘆”對乳腺癌細胞的抑制效果有顯著優勢，本實驗基于網絡藥理學的研究，發現“山慈菇-漏蘆”對乳腺癌的部分作用靶點以及具體作用機制，為中醫藥抗乳腺癌多靶點、多途徑以及作用機制相關的研究提供了方法學借鑒，并為治療乳腺癌的臨床研究提供了理論支持和研究思路。

　　利益沖突：本文不存在任何利益沖突。