鈦植入物表面生物化學(xué)改性對骨整合的影響

　　摘要背景：鈦及鈦合金因具有良好的機(jī)械性能和生物惰性等被廣泛應(yīng)用于骨科植入領(lǐng)域。目的：綜述不同的生物分子搭載到鈦植入物表面對骨整合的影響。方法：由第一作者應(yīng)用計算機(jī)以“titanium，osseointegration，biochemical modification，coating”為英文檢索詞，以“鈦，骨整合，生物化學(xué)改性，涂層”為中文檢索詞，應(yīng)用計算機(jī)檢索PubMed、Web of Science、維普、萬方、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中1991-2020年已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，并進(jìn)行篩選、歸納與總結(jié)，最終納入104篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：鈦植入體表面單一的物理和化學(xué)修飾方式主要是間接影響細(xì)胞行為，而生物分子涂層可以直接參與生物過程，這在誘導(dǎo)骨形成方面更有效，不僅顯著提高了骨與植入體之間早期的骨整合，還降低了因炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的手術(shù)失敗及假體翻修發(fā)生率。雖然鈦植入物的生物化學(xué)改性可以直接參與生物過程，但是目前還有許多問題尚待解決：生物活性物質(zhì)在鈦植入體表面的長期穩(wěn)定性、釋放的速率以及鈦植入物與機(jī)體細(xì)胞和組織之間的作用機(jī)制問題還需進(jìn)一步研究，從而得到骨與鈦植入物之間的早期和長期的骨整合。

　　關(guān)鍵詞：鈦;植入物;骨整合;表面改性;生物化學(xué)改性;涂層;生物活性分子;成骨分化

　　車振家; 朱正清; 朱禮偉; 李友斌; 祝晨一; 黃嵐峰， 中國組織工程研究 發(fā)表時間：2021-11-26

　　0 引言 Introduction

　　創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)炎、骨轉(zhuǎn)移、骨壞死、骨質(zhì)疏松等骨科疾病嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量 [1-2]。對于這些疾病的治療，通常使用骨科內(nèi)植入物，如自異體骨 [3]、關(guān)節(jié)假體、鋼板和螺釘 [4-5]。由于純鈦和鈦合金固有的生物惰性和良好的機(jī)械性能，被廣泛應(yīng)用于骨科和牙科植入 [6]。據(jù)研究報道，良好的骨整合是鈦種植體與骨界面長期結(jié)合的關(guān)鍵 [7]，但鈦種植體周圍的骨形成不足是制約著它們應(yīng)用的原因 [8]。為了實現(xiàn)更好的骨整合，各種研究都試圖對鈦種植體表面進(jìn)行改良 [9]。改變表面性能 ( 如微、亞微和納米尺度的形貌和濕潤性 [10]) 和在支架表面搭載無機(jī)物等傳統(tǒng)的植入修飾技術(shù)，對提高成骨活性較為有限 [11-13]，這種基于物理和化學(xué)的表面修飾方式主要是間接影響細(xì)胞行為，而將生物分子固定在鈦種植體表面的生物化學(xué)改性可以直接參與生物過程，這在誘導(dǎo)骨形成方面更有效 [14-15]， 尤其是在骨狀況不佳的情況下 [16]。

　　目前常用的生物分子有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 [17]、多肽 [18-19]、生長因子 [20-21]、多糖和核苷酸等 [22-24]。因此，許多研究采用種植體表面生物化學(xué)涂層的方法來促進(jìn)種植體周圍骨再生，以改善骨質(zhì)結(jié)構(gòu)并提高種植體骨結(jié)合率。文章針對鈦種植體表面的 5 種生物化學(xué)改性對種植體周圍骨結(jié)合影響的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展進(jìn)行綜述。

　　1 資料和方法 Data and methods

　　1.1 資料來源 由 第 一 作 者 應(yīng) 用 計 算 機(jī) 以“titanium， osseointegration，biochemical modification，coating”為英文檢索詞，以“鈦，骨整合，生物化學(xué)改性，涂層”為中文檢索詞，應(yīng)用計算機(jī)檢索 PubMed、Web of Science、維普、萬方、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中 1991-2020 年已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，并進(jìn)行篩選、歸納與總結(jié)，最終納入 104 篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

　　1.2 入選與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①與鈦植入物表面生物化學(xué)改性密切相關(guān)的文章;②與生物活性物質(zhì)對種植體骨整合產(chǎn)生積極作用的文章;③同一領(lǐng)域的相關(guān)研究選擇近年發(fā)表的文獻(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)性研究;相關(guān)性差及無關(guān)文章。

　　1.3 資料提取 根據(jù)檢索詞共檢索到 297 篇相關(guān)文獻(xiàn)，閱讀標(biāo)題和摘要，按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后最終共納入 104 篇文獻(xiàn)進(jìn)行分析和整理。文獻(xiàn)檢索流程圖，見圖 1。

　　2 結(jié)果 Results

　　2.1 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白

　　2.1.1 膠原蛋白 Ⅰ型膠原蛋白已被證明是一種生物相容性高的有機(jī)生物材料，植入后容易被宿主組織吸收 [25]，可以有效改善種植體周圍的骨重塑 [26]。SCARANO 等 [27] 先將鈦植入物進(jìn)行噴砂和酸蝕處理，再將Ⅰ型膠原蛋白共價結(jié)合到經(jīng)過處理的鈦植入物表面，將其植入到兔膝關(guān)節(jié)中，在第 15， 30，60 天進(jìn)行組織學(xué)分析和 Micro-CT 斷層掃描，對涂覆和未涂覆膠原植入物的種植體骨結(jié)合率、骨區(qū)域內(nèi)螺紋和骨區(qū)域外螺紋進(jìn)行分析，結(jié)果顯示鈦種植體表面的Ⅰ型膠原蛋白提高了鈦種植體表面生物活性，并且加速了早期成骨。然而，膠原蛋白存在著動物源性膠原的免疫反應(yīng)和酶的快速降解等缺點，限制了其應(yīng)用 [28]。為了克服這些缺點，大多數(shù)膠原蛋白都是在交聯(lián)后使用的，目前多采用化學(xué)試劑的方式進(jìn)行交聯(lián)，但這種方式所殘留的化學(xué)試劑會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用，而伽馬輻射交聯(lián)的方式可以克服這一缺點 [29]。

　　BAE等[30]通過伽馬照射將膠原蛋白交聯(lián)到植入物表面，由于交聯(lián)過程無化學(xué)試劑的參與，所以體外細(xì)胞實驗無毒性作用和化學(xué)試劑的不良反應(yīng)，而且表現(xiàn)出較高的成骨分化和成骨基因的表達(dá);將鈦植入物植入到小鼠脛骨模型中，對該模型進(jìn)行組織學(xué)分析和 Micro-CT 斷層掃描，結(jié)果顯示出良好的骨整合能力，并且也沒有受到化學(xué)試劑的影響。

　　2.1.2 骨橋蛋白 在骨整合過程中，骨內(nèi)種植體周圍的骨橋蛋白在直接成骨過程中是必不可少的。MAKISHI 等 [31] 將經(jīng)過噴砂處理過的鈦種植體分別放置于骨橋蛋白基因敲除和野生的小鼠的上頜內(nèi)，植入 3，5，7，28 d 后，使用免疫組化、原位雜交和電子探針纖維分析儀對標(biāo)本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，骨橋蛋白缺陷干擾了直接成骨，延遲了種植體的骨整合。 FIORELLINN 等 [32] 將骨橋蛋白涂覆在等離子噴涂鈦的表面，并與未涂覆的等離子噴涂鈦進(jìn)行對比，犬模型的組織形態(tài)計量學(xué)分析顯示，第 4 周時涂覆組植入物的骨 - 植入物接觸和周圍骨密度明顯高于未涂覆組，這使植入手術(shù)產(chǎn)生更高的可預(yù)測性，并且降低了其風(fēng)險。

　　2.1.3 纖維連接蛋白 在不同的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，纖連蛋白已被證明能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞反應(yīng) [33]，它包含多個結(jié)構(gòu)域，不僅與細(xì)胞相互作用，還與其他蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)許多細(xì)胞過程，如細(xì)胞黏附、遷移、生長和分化 [34]。不僅如此，纖連蛋白搭載在鈦表面上時還能有效支持細(xì)胞生長。 PRAMONO 等 [35] 先用噴砂機(jī)將鈦圓盤進(jìn)行噴砂處理，再將人血漿纖連蛋白涂布在經(jīng)過噴砂處理的鈦圓盤上，與小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 (MC3T3-E1 細(xì)胞 ) 聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)表面涂有纖連蛋白的噴砂鈦增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附和增殖;除此之外，基質(zhì)礦化和堿性磷酸酶活性也明顯增強(qiáng)。

　　PIVERA-CHACON 等 [36] 發(fā)現(xiàn)使用全長纖維連接蛋白可以使鈦植入物功能化，從而顯示出良好的骨傳導(dǎo)能力。然而，全長纖維連接蛋白也存在一些不足，首先是其對蛋白水解、降解敏感，還可能引起免疫反應(yīng) [37];其次是可以從人血漿中的純化纖連蛋白的量很少，因此其臨床應(yīng)用受到了阻礙 [38]。與此不同，GUILLEM-MARTI 等 [39] 將纖維連接蛋白重組片段組成的細(xì)胞外基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)與聚乳酸共靜電紡絲，并共價結(jié)合在拋光的鈦盤上，為了克服聚乳酸的細(xì)胞黏附能力不足、提高細(xì)胞反應(yīng)性，他們在納米纖維中加入了纖維連接蛋白的細(xì)胞附著位點片段，結(jié)果顯示其顯著改善了人成骨肉瘤 SaOS-2 細(xì)胞的生物反應(yīng)，提高了骨結(jié)合能力。在此基礎(chǔ)上，GUILLEMMARTI 等 [40] 還將纖維連接蛋白肝素結(jié)合Ⅱ片段引入精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列，使 DNA 突變生成了一個新的重組蛋白片段，再通過硅烷化法共價結(jié)合在鈦盤上。一方面，這種新蛋白在鈦上固定時可以提高細(xì)胞黏附性，同時保留了細(xì)胞分化能力;另一方面，它也表現(xiàn)出了良好的因子結(jié)合能力。所以，這種獲得重組蛋白的新策略為設(shè)計再生醫(yī)學(xué)活性分子打開了一個新的窗口。

　　2.2 活性肽類

　　2.2.1 成骨生長肽 成骨生長肽是一種可溶性、短而線性的生長因子肽片段，在體外可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化，在體內(nèi)可以促進(jìn)骨形成和骨折愈合。由于成骨生長肽具有良好的骨誘導(dǎo)活性，所以當(dāng)其固定在表面和支架上時可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨生長 [41]。POLICASTRO 等 [42] 證明，成骨生長肽功能化聚苯丙氨酸基顯示了顯著的組織與支架整合能力，并能促進(jìn)其成骨。MOORE 等 [43] 還發(fā)現(xiàn)，通過點擊化學(xué)在合成底物上梯度固定成骨生長肽可以促進(jìn) MC3T3-E1 細(xì)胞增殖。然而，目前將成骨生長肽固定在鈦種植體表面以改善骨結(jié)合的研究還尚少。

　　LAI 等 [41] 在鈦表面通過陽極氧化制備了一層直徑約 70 nm 的定向二氧化鈦納米管，然后通過聚多巴胺中間層將成骨生長肽偶聯(lián)到二氧化鈦納米管上，體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，成骨生長肽功能化的二氧化鈦納米管能促進(jìn)成骨細(xì)胞的擴(kuò)散和分化。LIU 等 [44] 將成骨生長肽與被證明可以抑制核因子 κB 激活和 c-Fos 基因表達(dá)的 N- 乙酰半胱氨酸結(jié)合 [45]，合成了多功能肽成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸，然后通過硅烷化法將多功能肽共價結(jié)合在鈦表面，將其分別與 RAW264.7 細(xì)胞和成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，體外對破骨細(xì)胞分化因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的研究表明，Ti- 成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸表面可以抑制多核細(xì)胞的形成，抑制破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá);對成骨細(xì)胞的研究結(jié)果表明，Ti- 成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸底物能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和成骨。此研究為骨科領(lǐng)域制備生物功能化鈦及鈦合金植入物提供了新的思路和方法。

　　2.2.2 抗菌肽 目前對種植體和骨生物材料的研究主要集中在促進(jìn)種植體骨整合和誘導(dǎo)成骨兩個方面，而忽視了這一過程出現(xiàn)的免疫炎癥反應(yīng)。然而，種植體放置后的早期炎癥反應(yīng)和周圍的慢性炎癥反應(yīng)對種植體骨整合的長期生存都是不利的 [46]，這往往導(dǎo)致體內(nèi)和體外研究的沖突和分歧 [47]。為了改善這一現(xiàn)狀，近年來許多研究開始嘗試將抗菌性能納入成骨性能的評價體系 [48]，但是由于抗菌活性的有效性和生理環(huán)境協(xié)調(diào)性之間的差異，目前還沒有獲得最佳解決方案 [49]。

　　植入物表面的抗菌涂層作為一種抗菌材料在臨床研究中取得了一定的成功，該技術(shù)最大的優(yōu)點是能使用的抗菌藥物種類多，控釋可行性強(qiáng) [50]，例如：TAHERI 等 [51] 制備納米銀顆粒涂層，顯示出顯著的抗菌效果;BADAR 等 [52] 制備了負(fù)載環(huán)丙沙星的層狀雙氫氧化物涂層，以延長抗生素的釋放。然而在轉(zhuǎn)化應(yīng)用方面，金屬顆粒和抗生素涂層在持續(xù)使用方面都有其自身的局限性，特別是耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了替代藥物的發(fā)展 [53]。而抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以規(guī)避抗生素的耐藥性問題 [54]，其中抗菌肽 LL-37 具有良好的抗菌特性和生物相容性，是一種理想的抗菌劑，它不僅可以殺滅細(xì)菌，還能促進(jìn)血管生成和招募免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等多種生理活動[8]，已被證實在宿主防御和損傷愈合過程中具有多效性 [55]。

　　HE 等 [56] 先將鈦種植體進(jìn)行微弧氧化處理，再用聚多巴胺為中間層將抗菌肽 LL-37 連接到鈦植入物表面，最后用磷脂在最外層覆以包衣形成復(fù)合涂層，將經(jīng)過不同處理的鈦表面與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌聯(lián)合培養(yǎng)，以驗證復(fù)合涂層的抗菌活性和抗菌率，第 6 小時的抗菌活性結(jié)果顯示，在裸鈦上培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形狀是完整和飽滿的，而接種在復(fù)合涂層上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化，其中細(xì)菌膜變得皺縮和破碎，這表明 LL-37 的抗菌機(jī)制是破壞細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu);第 24 小時的抗菌率結(jié)果顯示，只經(jīng)過微弧氧化的鈦表面對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為 25% 和 24.6%，而經(jīng)過抗菌肽 LL-37 修飾過的鈦表面對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率達(dá)到了 71.4% 和 66.7%，抗菌率的實驗結(jié)果與早期的抗菌實驗結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，他們還將不同處理的鈦表面與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)來驗證復(fù)合涂層的生物相容性，結(jié)果顯示復(fù)合涂層組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性均未顯示出負(fù)面影響，這為制備同時具有抗菌效果和細(xì)胞相容性的抗菌鈦植入物提供了一種方法。

　　抗菌肽 LL-37 還可以顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和旁分泌因子的表達(dá) [57]。HE 等 [8] 經(jīng)過微弧氧化和水熱兩步處理在種植體表面沉積羥基磷灰石，再通過聚多巴胺中間層將抗菌肽 LL-37 覆以種植體表面形成復(fù)合涂層，然后再將其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，通過體外實驗和體內(nèi)實驗得出：抗菌肽 LL-37 涂層可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移，刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生營養(yǎng)反應(yīng)，植入體鈦表面的顯微結(jié)構(gòu)與羥基磷灰石沉積可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。這為通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移來提高鈦植入體的骨整合性能提供了一種可能。

　　除抗菌肽 LL-37 外，多肽 GL13K 是存在于人體中典型的陽離子抗菌肽之一。CHEN 等 [47] 以硅烷為化學(xué)連接劑將抗菌肽 GL13K 固定在種植體鈦表面，并與 RAW264.7 細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，通過 ELISA 和 qRT-PCR 分別檢測了不同極化的巨噬細(xì)胞炎性、抗炎細(xì)胞因子、炎癥相關(guān)基因及抗炎基因的表達(dá)，研究表明抗菌肽 GL13K 固定的鈦表面可以調(diào)節(jié) M1 巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放，抑制巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌，促進(jìn) M2 巨噬細(xì)胞抗炎因子的釋放。巨噬細(xì)胞可以由促炎極化狀態(tài)向抑炎極化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)炎癥過程向組織愈合過程轉(zhuǎn)化，后期還可能影響骨整合。LI 等 [58] 利用氧化處理在鈦種植體表面覆以二氧化鈦納米管，通過浸泡技術(shù)把抗菌肽 GL13K 固定于表面形成復(fù)合涂層，并且在體外將其與 MC3T3-E1 細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示抗菌肽 GL13K 早期可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞附著，中早期可預(yù)防種植體感染，后期可促進(jìn)骨整合。

　　2.2.3 精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列 (RGD 序列 ) RGD 序列能促進(jìn)成骨細(xì)胞在骨科植入物上的黏附和增殖，并且在鈦植入物上固定有 RGD 序列的涂層已被證明具有良好的骨整合性 [59]，在體外不僅可以刺激成骨細(xì)胞的分化，還對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化具有積極的作用 [60];在體內(nèi)可以增加骨與種植體界面的結(jié)合程度，從而縮短種植周期，提高種植成功率 [61]。 PARFENOVA 等 [19] 用等離子體電解氧化技術(shù)在鈦表面形成無機(jī)多孔亞層，再通過雙膦酸鹽為化學(xué)連接劑，將線性 RGD 序列共價偶聯(lián)到鈦表面形成復(fù)合涂層，體外對成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖和活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明經(jīng)過雙膦酸鹽連接的鈦表面會促進(jìn)細(xì)胞的增殖，未修飾的鈦表面對細(xì)胞增殖無影響。然而，對于功能化的鈦植入物的體內(nèi)研究還需進(jìn)一步的實驗。

　　此外，不同構(gòu)象的 RGD 序列固定在鈦植物表面可能對骨整合產(chǎn)生不同的效果。HELLER 等 [18] 采取硅烷化法將環(huán)狀 RGD 序列和線狀 RGD 序列分別共價偶聯(lián)在鈦表面，比較兩者在體外和體內(nèi)對骨反應(yīng)的影響，在體外將成骨細(xì)胞分別與不同鈦表面聯(lián)合培養(yǎng)，對其細(xì)胞黏附、增殖、分化及堿性磷酸酶和骨鈣素進(jìn)行評價;在體內(nèi)將不同表面處理的鈦植入兔脛骨近端，并對骨的生長參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在體外，環(huán)狀 RGD 序列和線狀 RGD 序列修飾鈦組作用差異不大，但均強(qiáng)于未處理的鈦組;體內(nèi)研究表明，在植入的第 3 周和第6 周，環(huán)狀 RGD 序列修飾組的骨與種植體結(jié)合率均高于其他組，這些發(fā)現(xiàn)可以前瞻性地應(yīng)用于植入材料，提高植入的成功率。

　　2.3 生長因子

　　2.3.1 血小板衍生生長因子家族 血小板衍生生長因子家族主要包括血小板衍生生長因子和血管內(nèi)皮生長因子，其中血小板衍生生長因子是組織修復(fù)的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在組織損傷后由血小板釋放，通過增加細(xì)胞的增殖和趨化性來加快愈合過程 [62]。血小板衍生生長因子在鈦表面的首次應(yīng)用是在 1991 年的一項動物研究中 [63]。在此基礎(chǔ)上，ORTOLANI 等 [64] 發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子與胰島素樣生長因子 1 結(jié)合后，一方面增加了種植體周圍間隙的骨填充，另一方面可有效改善兔股骨干骺端種植體周圍骨整合的能力。KIM 等 [65] 也發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子與骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 一同接種于肝素化的鈦表面可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能和骨整合。

　　MA 等 [66] 通過陽極氧化和化學(xué)介導(dǎo)將血小板衍生生長因子以共價結(jié)合的方式固定在植入體鈦表面，建立了一種新型的二氧化鈦納米管表面結(jié)構(gòu)，并且在大鼠股骨遠(yuǎn)端模型中局部植入后，可以在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中見到骨鈣素表達(dá)的爆發(fā)，反映了經(jīng)過表面修飾的鈦植入物周圍骨形成的增強(qiáng)。血管形成依賴于血管內(nèi)皮生長因子，除了促進(jìn)血管生成以外，血管內(nèi)皮生長因子還可促進(jìn)成骨 [67-68]。此外，血管形成還可影響骨的生理性愈合 [69]。IZQUIERDO-BARBA 等 [70] 在 Ti6Al4V 支架上涂敷含硅的羥基磷灰石 (SiHA)，并在涂層表面搭載血管內(nèi)皮生長因子，體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗證明，吸附血管內(nèi)皮生長因子的支架可促進(jìn)支架表面內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，含硅羥基磷灰石涂層的支架可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖;對綿羊模型的體內(nèi)研究表明，在搭載血管內(nèi)皮生長因子的含硅羥基磷灰石涂層支架上表現(xiàn)出協(xié)同作用，表現(xiàn)為更多的骨化和血管生成。 2.3.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族 骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族從屬于轉(zhuǎn)化生長因子 β 超家族，在骨的創(chuàng)傷修復(fù)和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化中起重要作用 [71-72]。在已知的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員中，目前研究較多的主要是骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2，6，7 和 9，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 是目前應(yīng)用最廣泛的生長因子之一，其在骨再生過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，將合成支架與生長因子相結(jié)合后生長因子可以促進(jìn)骨結(jié)合和血管的形成，能很好地愈合創(chuàng)傷造成的嚴(yán)重骨缺損 [73]，但由于骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 的半衰期短、擴(kuò)散緩慢，存在短距離擴(kuò)散和局部作用，其必須以可控和持續(xù)的方式攜帶和釋放 [74]。

　　TENG 等 [75] 首先采用微弧氧化技術(shù)對多孔鈦合金進(jìn)行表面處理，然后通過電化學(xué)沉積將鈣(Ca)和磷(P)結(jié)合到孔隙中，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 對 Ca、P 包覆鈦進(jìn)行功能化，體外實驗表明，微弧氧化 -CaP- 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 可促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，形成種植體中心;此外，他們還進(jìn)行了新西蘭大白兔顱骨植入實驗，結(jié)果表明種植體的固定能力增強(qiáng)，具有明顯促進(jìn)骨愈合的潛力，同時沉積在 Ca、P 層的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 釋放時間可延長至 35 d。WANG 等 [74] 首先采用微弧氧化法在鈦表面制備羥基磷灰石和二氧化鈦復(fù)合涂層，然后采用浸涂法將骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 包裹的殼聚糖涂層負(fù)載在鈦表面。這種復(fù)合涂層改變了鈦植入體的生物性能，提高了其抗菌性，也改善了骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 的釋放行為。

　　CHEN 等 [76] 通過堿和熱處理來制作多孔鈦植入物與超親水性和負(fù)電荷表面，然后通過物理吸附將帶正電荷的魚精蛋白、帶負(fù)電荷的海藻酸鹽、最外層帶正電荷的魚精蛋白在多孔鈦植入物表面制備了“三明治樣”涂層，然后利用生物功能化技術(shù)進(jìn)一步固定骨形態(tài)形成蛋白 2，從而形成多孔鈦植入物 - 魚精蛋白 / 海藻酸鹽 / 魚精蛋白 - 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 生物涂層，體外生物學(xué)功能及體內(nèi)成骨研究結(jié)果表明，多孔鈦植入物 - 魚精蛋白 / 海藻酸鹽 / 魚精蛋白 - 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 顯著改善了 MC3T3-E1 細(xì)胞的體外成骨分化，并且在體內(nèi)可能通過激活整合素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 /Smad 信號通路來增強(qiáng)體內(nèi)大鼠模型的骨整合。除單因子外，有些研究通過雙因子包覆在鈦種植體表面來研究骨整合的可行性。與骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 相比，生長分化因子 5 作為促進(jìn)骨形成的生長因子較少為人所知。YANG 等 [77] 用肝素為中間涂層將骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 和生長分化因子 5 涂敷在種植體鈦表面，結(jié)果表明，一方面可以延長涂層的控釋時間至 30 d;另一方面，兩種生長因子包覆的鈦增強(qiáng)了種植體與骨界面的骨形成和骨整合。

　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 在骨愈合過程中起著重要的作用 [78]。 BRIGAUD 等 [79] 將骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 與纖連蛋白結(jié)合在鈦 - 羥基磷灰石表面來測試其生物活性，結(jié)果顯示纖連蛋白 - 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 誘導(dǎo)骨整合，并與其他實驗組相比產(chǎn)生了最小的不良反應(yīng)。除了對骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 單因子的研究，有實驗將骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 與血小板衍生生長因子雙因子涂敷在植入體表面進(jìn)行研究。KECELI 等 [80] 將鈦植入物進(jìn)行陽極氧化處理，用浸泡法在陽極氧化處理表面負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6，再通過靜電紡絲將絲素蛋白和血小板生長因子涂敷在鈦表面，形成陽極氧化處理 - 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6- 血小板生長因子 - 絲素蛋白復(fù)合涂層，在體外實驗顯示，由于骨形態(tài)發(fā)生蛋白 6 和血小板衍生生長因子可控釋放的雙重作用，該涂層細(xì)胞增殖、礦化和基因表達(dá)水平均增高，但是對骨整合的更進(jìn)一步影響需要通過體內(nèi)實驗證明。

　　與成骨早期參與作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 相比，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7 主要在骨形成的后期發(fā)揮作用 [81]。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7 還可誘導(dǎo)未分化的非成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并刺激已轉(zhuǎn)化的成骨細(xì)胞成熟 [82]，在體內(nèi)也顯示出良好的骨再生能力 [83]。 AL-JARSHA 等 [84] 用聚丙烯酸乙酯溶液在鈦表面進(jìn)行旋涂，通過物理相互作用在鈦表面形成聚丙烯酸乙酯層，再將已經(jīng)暴露生長因子和整合素結(jié)合域的纖維連接蛋白特異地結(jié)合在聚丙烯酸乙酯層表面，這種方法可以用極低濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7(25 µg/L) 使這些底物功能化，從而創(chuàng)造一個微環(huán)境促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。他們還對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外實驗，結(jié)果表明該復(fù)合涂層具有良好的生物相容性及晚期成骨分化的能力，這項技術(shù)開辟了局部使用極低劑量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白7來使骨結(jié)合最大化的途徑，從而提高了種植體的可行性。

　　在骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 被認(rèn)為是最具骨誘導(dǎo)分化能力的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一 [85-87]，但是目前關(guān)于骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 對成骨細(xì)胞和鈦之間相互作用的研究相對較少。SOUZA 等 [85] 將 MC3T3-E1 細(xì)胞與鈦共同培養(yǎng)，基于劑量反應(yīng)實驗選擇了最適濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 (20 nmol/L) 來評價骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 對生長在鈦表面成骨細(xì)胞分化的影響，結(jié)果表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2、骨鈣素和骨涎蛋白的高表達(dá)，并增加堿性磷酸酶活性和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。然而，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 搭載到鈦表面的研究還需要進(jìn)一步探索。

　　2.4 多糖類

　　2.4.1 核心蛋白多糖 核心蛋白多糖是一種常見的細(xì)胞外基質(zhì)分子，是一種小的富含亮氨酸的蛋白聚糖，由核心蛋白和糖胺聚糖鏈組成 [88]。MOHAN 等 [89] 研究發(fā)現(xiàn)，核心蛋白多糖可以通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)纖維結(jié)構(gòu)抑制纖維包封。此外，核心蛋白多糖在體外也能促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。 HE 等 [90] 用聚多巴胺將核心蛋白多糖負(fù)載在鈦的表面，觀察纖維包被抑制和骨生長，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞實驗結(jié)果表明，在核心蛋白多糖修飾的表面上，一方面成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成功能明顯減弱;另一方面其還可以增強(qiáng)鈣沉積和堿性磷酸酶活性。這種抑制了成纖維細(xì)胞的增殖、改善了成骨細(xì)胞功能的方法，對骨科種植體的強(qiáng)化具有潛在的應(yīng)用價值。

　　2.4.2 殼聚糖和透明質(zhì)酸 殼聚糖具有良好的生物相容性、降解性和抗菌性，是一種用于骨再生的生物活性物質(zhì)，并且由于殼聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的相似性，基于殼聚糖的復(fù)合材料可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化 [91]。 RASTEGARI 等 [92] 對 Ti6Al4V 進(jìn)行了堿處理和殼聚糖 - 二氧化硅納米復(fù)合涂層處理，納米復(fù)合涂層不僅提高了 Ti6Al4V 合金的生物性能，還增強(qiáng)了基底的表面濕潤性、磷灰石形成能力、腐蝕保護(hù)、細(xì)胞活力和細(xì)胞黏附性。PALLA-RUBIO 等 [93] 介紹了溶膠 - 凝膠法合成硅 - 殼聚糖雜化膜的方法，體外細(xì)胞培養(yǎng)分析表明，雜化膜對細(xì)胞無毒并能促進(jìn)細(xì)胞增殖，其雜化膜中的殼聚糖不僅可以提高抗菌性，而且調(diào)節(jié)了硅的釋放，對骨再生也起著重要的作用。

　　除殼聚糖外，透明質(zhì)酸也是一種天然多糖，在生物反應(yīng)啟動中起著重要作用。VALVERDE 等 [94] 通過逐層沉積將透明質(zhì)酸和殼聚糖搭載到 Ti6Al4V 表面，對其進(jìn)行了表面改性，實驗結(jié)果表明，這種涂層不僅增加了鈦植入物的抗菌性能，也提高了植入手術(shù)的成功率。

　　2.5 核苷酸類

　　2.5.1 siRNA 核糖核酸干擾技術(shù)是一種通過沉默特定基因來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的理想方法，被廣泛應(yīng)用于靶向治療或植入物表面修飾的研究 [95]。越來越多的研究表明，功能性生物涂層如 siRNA 涂層、miRNA 涂層，可以通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和黏附來改善鈦種植體的表面生物相容性 [96]。此技術(shù)不僅可以提高植入成功率、增加植入體的穩(wěn)定性、改善植入體周圍軟組織的整合，還可以通過其抗菌特性減少植入體周圍的炎癥 [97]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制組織蛋白酶 K 可有效抑制破骨細(xì)胞分化，增加血小板源性生長因子水平，促進(jìn)成骨的血管生成 [98]。 XING 等 [95] 開發(fā)了一種新的分級納米結(jié)構(gòu)，用作臨床使用的鈦植入物表面涂層，將靶向調(diào)節(jié)組織蛋白酶 K 的 siRNA 通過明膠涂覆在金納米粒子上，形成金納米粒子 -siRNA- 抑制組織蛋白酶 K，再將修飾過的金納米粒子再一次通過明膠逐層沉積構(gòu)建在鈦種植體表面上，產(chǎn)生功能化納米粒子的多層結(jié)構(gòu)，植入體 - 骨界面上 siRNA- 抑制組織蛋白酶 K 修飾的金納米粒子的受控釋放使得基因沉默過程更加精確，不僅用于抑制破骨細(xì)胞分化，還用于刺激血管生成和成骨。

　　siRNA 還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在炎癥因子中最有效的是腫瘤壞死因子 α，它在局部參與了骨關(guān)節(jié)炎中軟骨的損傷，并且血清中腫瘤壞死因子 α 水平可用于提示骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。 WANG 等 [99] 通過對鈦表面進(jìn)行陽極氧化處理和殼聚糖 / 三聚磷酸鹽 - 透明質(zhì)酸鈉納米顆粒將 siRNA 負(fù)載在植入體鈦表面，形成殼聚糖 / 三聚磷酸鹽 - 透明質(zhì)酸鈉 -siRNA 納米顆粒，實驗建立了小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠單核細(xì)胞系 RAW264.7 細(xì)胞的間接共培養(yǎng)體系，將預(yù)先激活的 RAW264.7 細(xì)胞置于 transwell 小室的上室，將 siRNA 修飾的植入鈦置于下室，以評估 siRNA 對腫瘤壞死因子 α 的調(diào)控以及對成骨分化的影響，研究證實，活化 RAW264.7 細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子 α 可顯著影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，通過 siRNA 修飾的鈦表面腫瘤壞死因子 α 遠(yuǎn)距離下調(diào)，炎癥因子解除后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化得到改善。siRNA 是不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)，其應(yīng)用仍然有限。siRNA 的應(yīng)用需要有效的遞送系統(tǒng)和載體，如用于遞送 siRNA 的納米顆粒等。通過負(fù)載 siRNA 進(jìn)行表面修飾后，鈦及其合金可以促進(jìn)相關(guān)成骨細(xì)胞或干細(xì)胞的附著和成骨分化，并促進(jìn)相關(guān)成骨標(biāo)記物的表達(dá) [23, 100]。

　　2.5.2 miRNA miRNAs 是內(nèi)源性非編碼單鏈 RNA，長度約為 22 個核苷酸，在細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多樣的基礎(chǔ)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs 模擬自然分化途徑，并控制多個基因，構(gòu)成一個更完善的干細(xì)胞分化刺激因子。近年來，關(guān)于 miRNAs 對成骨的調(diào)控作用的報道不斷增多 [101]，其中 miR-138 被報道為間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的負(fù)調(diào)控因子，Anti- miR-138 抑制內(nèi)源性 miR-138 水平可增強(qiáng)體內(nèi)的骨形成 [102]。 WU 等 [16] 將殼聚糖 -AntimiR-138 配合物和透明質(zhì)酸鈉作為帶正電荷和負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，采用分層方法制備聚電解質(zhì)多層膜，再通過硅烷化法將聚電解質(zhì)多層膜共價結(jié)合在經(jīng)過微弧氧化的鈦表面，體外轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示殼聚糖 -AntimiR-138 納米顆粒被細(xì)胞有效吸收，并導(dǎo)致 miR-138 顯著下調(diào)，但未顯示出顯著的細(xì)胞毒性，殼聚糖-AntimiR-138/ 透明質(zhì)酸鈉聚電解質(zhì)多層膜表面增強(qiáng)了間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和堿性磷酸酶、膠原生成和細(xì)胞外基質(zhì)礦化，在大鼠模型中觀察到體內(nèi)骨結(jié)合顯著增強(qiáng)。這種新型 miRNA 功能化鈦種植體可用于臨床，以實現(xiàn)更有效、更穩(wěn)定的骨整合。此外，miR-21 也已被證明與骨骼發(fā)育有關(guān)，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié) [103]。GENG 等 [104] 將鈦種植體依次通過酸處理、鍶磷灰石沉積和 miR-21 納米膠囊固定進(jìn)行改性，這種涂層不僅能促進(jìn)血管生成因子 CD31 的表達(dá)，還能增強(qiáng)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成血管和成骨。

　　3 小結(jié)與展望 Conclusions and prospects

　　綜上所述，鈦種植體表面的生物化學(xué)改性已經(jīng)成為提高種植體骨整合的有效方法，相關(guān)研究受到了廣泛關(guān)注。目前的研究結(jié)果表明，種植體表面的生物化學(xué)改性主要是將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、活性肽類、生長因子類、多糖類和核苷酸類 5 種生物活性物質(zhì)搭載在植入體表面，實現(xiàn)了植入體生物表面活化。

　　鈦或鈦合金植入物經(jīng)過微弧氧化、噴砂、酸蝕、水熱法、等離子噴涂、電化學(xué)沉積等物理或化學(xué)改性的方法在植入物表面制備氧化膜或者粗糙表面，這種理化改性可以改變鈦或鈦合金植入物表面的濕潤度、親水性、電荷、形貌等，也為生物活性分子的搭載提供了條件。同時，在此基礎(chǔ)上將二氧化鈦納米管、鈣磷涂層、羥基磷灰石、明膠、殼聚糖、肝素或聚多巴胺等作為載體，通過靜電紡絲、簡單涂敷、物理吸附、硅烷化法或?qū)訉幼越M裝技術(shù)等不同方法將生物活性分子搭載到鈦植入物表面，使其在骨與鈦植入物之間形成一層具有一定生物活性的涂層。通過這些方法將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、活性肽、生長因子、多糖和核苷酸搭載到鈦植入物表面，直接參與生物過程的生物化學(xué)改性主要有 3 個方面的優(yōu)勢：①首先，比單一的物理和化學(xué)改性具有更高的仿生性和更確切的成骨效果;②其次，在體外細(xì)胞學(xué)評價中生物活性分子可以直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化，并增加堿性磷酸酶活性和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，且進(jìn)一步的分子和基因水平顯示，活化的鈦植入物可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2、骨鈣素和骨涎蛋白等成骨相關(guān)基因的表達(dá);纖維連接蛋白還展現(xiàn)出了良好的因子結(jié)合能力，成骨生長肽除了促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和成骨外，還可以抑制破骨細(xì)胞的表達(dá);核心蛋白多糖可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)纖維結(jié)構(gòu)，從而抑制纖維包封;③最后，體內(nèi)實驗的組織學(xué)及 Micro-CT 等結(jié)果顯示，經(jīng)過生物化學(xué)改性的鈦植入物可以顯著提高骨與植入物的結(jié)合率，并且加速早期成骨。此外，抗菌肽和核苷酸等的修飾還可以改善骨整合過程中另一重要的炎癥反應(yīng)，經(jīng)過抗菌修飾的鈦植入物可以抑制植入手術(shù)的早期炎癥反應(yīng)及種植體周圍的慢性炎癥，從而降低因炎癥反應(yīng)引起的手術(shù)失敗和假體翻修概率，增加了手術(shù)的可預(yù)測性，降低了其風(fēng)險。

　　目前要將這種鈦植入物表面的修飾技術(shù)大量應(yīng)用于臨床，還有 4 個問題需要解決：首先，生物活性分子在鈦植入物表面的結(jié)合強(qiáng)度較低時，會導(dǎo)致涂層的松動或者在植入體內(nèi)過程中存在涂層因摩擦而大量磨損消耗的問題;其次，生物活性分子搭載后的完整性、微觀結(jié)構(gòu)和天然構(gòu)象是否發(fā)生了改變，以及經(jīng)過修飾后的鈦植入物如何在表面干燥的情況下長期保存;再者，生長因子的搭載量、釋放量、釋放率和釋放時間都難以控制，都需要進(jìn)一步優(yōu)化而達(dá)到適量、均一、緩慢、長期的釋放效果;最后，在鈦植入物表面搭載多種物質(zhì)而制備的復(fù)合涂層中的某一種物質(zhì)會存在降解問題，比如含有殼聚糖的復(fù)合涂層在殼聚糖完全降解時其抗菌性能就會消失，這樣難以維持復(fù)合涂層的長期穩(wěn)定性。此外，在復(fù)合涂層的多種物質(zhì)中存在著協(xié)同或者拮抗的作用，這難以控制該復(fù)合涂層中的每一種物質(zhì)都達(dá)到最適的搭載量。除了這些問題，有些實驗的結(jié)果顯示出體內(nèi)和體外研究結(jié)果的沖突和分歧，這都亟需深入探討。

　　隨著植入體和生物材料的不斷發(fā)展，在今后會發(fā)現(xiàn)更加理想的搭載方法以及生物活性物質(zhì)，從而解決目前存在的問題。首先，將物理、化學(xué)和生物化學(xué)改性更加有機(jī)地結(jié)合在一起，從而使生物活性物質(zhì)產(chǎn)生更強(qiáng)的附著力，降低在植入過程中因摩擦而產(chǎn)生的損耗;其次，在已經(jīng)用生物活性分子修飾過的鈦植入物表面再覆以磷脂或其他成分的外層包衣，這不但可以維持復(fù)合涂層的完整性，還可以延長其保存時間;再者，將生物活性物質(zhì)作為 3D 打印的材料，使其可以長期、穩(wěn)定、均勻地釋放，從而達(dá)到植入物的長期穩(wěn)定性;最后，理想的生物活性物質(zhì)或涂層不但可以促進(jìn)骨整合，而且還應(yīng)該具有抗炎等作用，所以將具有不同作用的生物活性分子共同搭載到同一鈦植入體表面，或者通過基因水平設(shè)計出同時滿足既抗菌又可以促進(jìn)成血管成骨的復(fù)合涂層。此外，還可以通過基因設(shè)計出產(chǎn)生靶向作用的物質(zhì)，從而使整個骨整合過程更加可預(yù)測。這些理想的搭載方法以及生物活性物質(zhì)，一方面可以增強(qiáng)種植體植入的早期和長期穩(wěn)定性，另一方面可以防止種植體周圍感染，并且滿足臨床應(yīng)用的可行性。然而，對于骨與植入體的生物相容性在分子甚至基因水平的研究，以及涂層對骨整合的具體調(diào)控機(jī)制等問題還需要不斷探索，早日實現(xiàn)種植體與骨組織之間的牢固、持久而直接的結(jié)合。