不同類型稻田亞硝酸型 CH4厭氧氧化潛力的比較研究

　　摘要：甲烷(CH4)厭氧氧化是稻田土壤中消減溫室氣體排放的重要過(guò)程。本試驗(yàn)選擇內(nèi)陸性南京稻田和濱海性上海崇明島圍墾稻田，比較研究稻田耕層(0～10 cm)和深層(50～60 cm)土壤中亞硝酸鹽型 CH4厭氧氧化(n-DAMO)潛力的差異及其微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制。結(jié)果表明，南京稻田耕層土壤的 n-DAMO 速率 為 3.51 µmol 13CO2·g-1 ·d-1， 顯 著 高 于 圍 墾 稻 田 耕 層 土 壤 (1.43 µmol 13CO2·g -1 ·d-1)。兩種類型稻田耕層土壤的 n-DAMO 速率均顯著高于深層土壤。南京稻田和圍墾稻田 M. oxyfera-like 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)分別為 (2.31~4.82)×107 和(0.89~2.12)×107 copies·g -1，與亞硝酸鹽型 CH4 厭氧氧化速率顯著正相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)碳、總氮、無(wú)機(jī)態(tài)氮是稻田 n-DAMO 速率分異的重要原因。綜上所述，內(nèi)陸性稻田土壤 n-DAMO 氧化潛力較高，其主要由較高的土壤本底碳、氮水平和功能微生物豐度所致。

　　關(guān)鍵詞：圍墾稻田;厭氧 CH4氧化; M. oxyfera 細(xì)菌豐度;深層土壤

　　薛夢(mèng)琪; 周聰; 饒旭東; 謝晴; 張耀鴻 南京信息工程大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2021-12-16

　　0 引言

　　甲烷(CH4)是一種重要的溫室氣體，具有很強(qiáng)的紅外吸收帶，其百年時(shí)間尺度上的增溫潛力是二氧化碳(CO2)的 28～34 倍[1]，占全球變暖貢獻(xiàn)率的 20%[2]。稻田是主要的 CH4 排放源，每年向大氣釋放 25～300 Tg [3]，占全球甲烷排放量的 10%～20%[4-5]。氮肥的施加導(dǎo)致稻田產(chǎn)生高濃度的 NOx -，為反硝化型厭氧甲烷氧化細(xì)菌和古菌提供了理想的生境[6]。目前認(rèn)為，亞硝酸型厭氧甲烷氧化(nitrite dependent Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, n-DAMO)過(guò)程由 NC10 門(mén)的 Candidatus Methylomirabilis oxyfera 細(xì)菌介導(dǎo)，該微生物具有內(nèi)產(chǎn)氧功能，可單獨(dú)將 NO2 -還原，同時(shí)將 CH4氧化為 CO2。n-DAMO 過(guò)程多發(fā)生于淡水濕地[7]、湖泊生態(tài)系統(tǒng)[8]等，近期在海洋生態(tài)系統(tǒng)中也檢測(cè)到了 nDAMO 過(guò)程的存在[9]。 Wang 等[10]報(bào)道濱海潮間帶生態(tài)系統(tǒng) DAMO 細(xì)菌與古菌可以共存，從而使潮間帶生態(tài)系統(tǒng)成為重要的 CH4匯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) n-DAMO 過(guò)程在 CH4循環(huán)過(guò)程中起著更重要的作用。

　　濕地生態(tài)系統(tǒng)中 n-DAMO 細(xì)菌介導(dǎo)的 CH4 厭氧過(guò)程受到土壤母質(zhì)、氮(N)水平、施肥、鹽分以及濕地剖面深度等因素的影響，其在稻田土壤中氧化作用表現(xiàn)強(qiáng)烈。Wang 等[10]發(fā)現(xiàn)在原位稻田濕地中, n-DAMO 細(xì)菌的數(shù)量與 NO3 -濃度呈顯著正相關(guān)。施入稻田的氮肥反硝化會(huì)產(chǎn)生 NO2 -，可以作為電子受體促進(jìn)土壤厭氧微域的 n-DAMO 反應(yīng)[6]。研究還發(fā)現(xiàn)：濕地系統(tǒng)不同深度土壤中 nDAMO 細(xì)菌的群落組成和活性存在明顯差異[11];一般認(rèn)為，相較于表層土壤，濕地深層土壤更有利于 n-DAMO 細(xì)菌的分布和 n-DAMO 反應(yīng)的發(fā)生[12]，可能是由深層土壤長(zhǎng)期處于較穩(wěn)定的缺氧狀態(tài)所致。n-DAMO 細(xì)菌群落在濱海生態(tài)系統(tǒng)中的分布存在較強(qiáng)的空間異質(zhì)性，其在杭州灣和長(zhǎng)江口濱海區(qū)中 n-DAMO 細(xì)菌的數(shù)量和活性均與土壤鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)[13-14]，其機(jī)理尚不清楚。

　　濱海濕地處于海陸交錯(cuò)帶，具有海洋性和陸地性雙重特征，當(dāng)前受人類活動(dòng)的影響日益嚴(yán)重。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的增長(zhǎng)，人類對(duì)土地的需求日趨迫切，濱海灘涂圍墾造田成為解決土地問(wèn)題的有效途徑。圍墾后的濕地自然條件相對(duì)穩(wěn)定、不再受海水潮汐的影響，形成與自然灘涂濕地明顯不同的獨(dú)特生境。在此基礎(chǔ)上，人工灌溉、耕作、施肥、水稻種植等農(nóng)業(yè)措施加速了圍墾稻田的熟土化進(jìn)程：由海洋性灘涂逐漸向陸地性農(nóng)田演替，土壤的物理、化學(xué)和生物特征發(fā)生了顯著改變，但與內(nèi)陸性稻田存在著明顯差別。這種圍墾植稻驅(qū)動(dòng)的熟土化作用對(duì)土壤甲烷氧化過(guò)程可能會(huì)產(chǎn)生重要影響。那么，處于熟土化進(jìn)程中的圍墾稻田，其甲烷厭氧氧化潛力有何特征?與典型內(nèi)陸性稻田相比，其甲烷厭氧氧化速率變化的主控因素是什么?是否與功能微生物群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量特征之間存在內(nèi)在關(guān)系?

　　鑒于此，本試驗(yàn)選取兩個(gè)不同類型的稻田：微堿性 N 貧瘠的長(zhǎng)江口崇明圍墾稻田和微酸性 N 豐富的南京稻田，研究其表層和深層土壤的 CH4厭氧氧化速率及 nDAMO 細(xì)菌的豐度，探明在土壤母質(zhì)、pH 值、N 水平以及鹽分等差異較大的稻田土壤環(huán)境中，n-DAMO 反應(yīng)速率及其微生物學(xué)機(jī)理，進(jìn)一步闡明其分異規(guī)律，為稻田 CH4減排提供參考依據(jù)。

　　1 材料與方法 1.1 土壤樣品采集

　　本研究選取上海市崇明島東灘濕地(121.92°E，31.50°N)圍墾 16 年稻田(WK)與南京信息工程大學(xué)農(nóng)業(yè)氣象試驗(yàn)站(118.86°E，32.16°N)荒地改種稻 15 年稻田(NJ)。在每個(gè)稻田內(nèi)以 S 形設(shè)置 6 個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)間距 15m。用土鉆取 0～60 cm 深度的土柱，取出 0～10 cm 和 50～60 cm 的土層樣品，并將相同深度的土樣充分混合，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

　　土壤全氮( TN) 含量采用半微量凱氏定量法測(cè)定。土壤總有機(jī)碳( TOC) 含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測(cè)定。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量用 2 mol/L KCl 溶液浸提后，采用 AA3 流動(dòng)分析儀測(cè)定。土壤 pH 值和 EC 值分別采用數(shù)字酸度計(jì)和電導(dǎo)儀測(cè)定。

　　1.3 厭氧 CH4氧化速率測(cè)定

　　將 5 g 土壤樣品放入 40 mL 的培養(yǎng)瓶后加入 10 mL 的超純水，膠塞密封后抽真空-充氬氣重復(fù)進(jìn)行 3 次，以達(dá)到嚴(yán)格厭氧狀態(tài)。室溫 25 ℃避光條件下 120 r/min 轉(zhuǎn)速預(yù)培養(yǎng) 2d，以盡可能去除殘余 O2 的影響。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，再次抽真空-充氬氣 2 次，然后將每個(gè)土樣分成 3 組，分別進(jìn)行底物添加處理：1) 添加 Ar;2) 添加 13CH4;3) 添加 13CH4 + NO2 -。每個(gè)處理 3 次重復(fù)。添加的 13CH4相對(duì)豐度為 99%，瓶?jī)?nèi)頂空剩余體積以氬氣補(bǔ)充，使得培養(yǎng)瓶頂空 13CH4 最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%。添加的 NO2 -最終濃度分別為 0.5 mmol。全部培養(yǎng)瓶在室溫 25 ℃ 避光條件下 120 r/min 轉(zhuǎn)速正式培養(yǎng) 7d。

　　培養(yǎng)結(jié)束后，用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀連用法測(cè)定瓶中 13CO2 的產(chǎn)生量。處理 1)為對(duì)照組，如果瓶中 13CO2 的相對(duì)豐度處于自然豐度水平(1.1%)，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可信度高;用處理 3) 減去處理 2)中 13CO2產(chǎn)生量，進(jìn)一步計(jì)算亞硝酸型厭氧甲烷氧化(n-DAMO)速率。

　　1.4 熒光定量 PCR 分析

　　用 Fast DNA Spin kit for soil 提取試劑盒 (MP Biomedicals, USA) 提取土壤樣品中的總 DNA。取部分 DNA 提取液用分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000 UVVis)測(cè)定 DNA 濃度和純度。土壤 DNA 保存于-80℃冰箱待用。在 CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad 公司)擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光定量 PCR 擴(kuò)增。測(cè)定土壤樣品中總細(xì)菌和 M. oxyfera 菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)。總細(xì)菌基因擴(kuò)增所用引物為細(xì)菌 V4+V5 高變區(qū)通用引物 515F/907R;M. oxyfera 菌擴(kuò)增所用引物為 qP1F/qP1R。反應(yīng)體系為 20.0 µL，包括 DNA 樣品 1.0 µL， Premix TaqTM 10 µL，前后引物各 1.0 µL，超純無(wú)菌水 7.0 µL。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性 95 ℃，10 min;變性 95 ℃，30 s;退火 55 ℃，30 s;延伸 72 ℃，30 s; 40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)質(zhì)粒梯度濃度制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)。

　　1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

　　用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析及多重比較、相關(guān)性分析(Pearson)進(jìn)行土壤理化性質(zhì)、氧化速率、微生物豐度的差異性以及相關(guān)性檢驗(yàn)，顯著水平 α = 0.05。

　　2 結(jié)果與分析 2.1 不同類型稻田土壤的理化性質(zhì)

　　南京稻田和崇明圍墾稻田土壤理化性質(zhì)如表 1 所示。南京稻田表層土壤中總有機(jī)碳(TOC)、總氮(TN)、NH4 +、NO3 -的含量均顯著高于深層土壤，表明農(nóng)業(yè)施肥、農(nóng)作物生長(zhǎng)等對(duì)耕層土壤有機(jī)質(zhì)和 N 水平影響很大。崇明圍墾稻田中表層土壤 TOC 顯著高于深層土壤，而 TN、NH4 +、NO3 -的含量在表層和深層之間無(wú)明顯差異，且圍墾稻田這些指標(biāo)均顯著低于南京稻田對(duì)應(yīng)土層，說(shuō)明圍墾稻田受土壤母質(zhì)、成土化進(jìn)程等影響，其土壤肥力普遍低于內(nèi)陸稻田。相反，圍墾稻田中表層和深層土壤的 SO4 2-含量、EC 值和 pH 值均顯著高于南京稻田，表明圍墾區(qū)稻田仍具有明顯的海洋性特征。

　　2.2 稻田土壤的 13CO2豐度變化和 CH4厭氧速率

　　本試驗(yàn)中，培養(yǎng)瓶密閉氣體中 13CH4 的起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為 10%，隨著厭氧培養(yǎng)的進(jìn)行將轉(zhuǎn)化為 13CO2，根據(jù)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)和豐度變化與培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，可得出培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的平均 n-DAMO 速率。圖 1 結(jié)果顯示，兩種類型土壤在只供應(yīng) Ar 氣體條件下厭氧培養(yǎng)后，其土壤 13CO2 豐度保持在自然豐度水平(1.08%);在供應(yīng) 13CH4和 13CH4+NO2 -條件下，土壤 13CO2豐度均有不同程度的升高，表明所試兩種土壤均發(fā)生了甲烷厭氧氧化反應(yīng)。其中，只供應(yīng) 13CH4 條件下 13CO2豐度顯著高于 Ar 處理，表明土壤中存在本底性電子受體可促進(jìn)甲烷厭氧氧化過(guò)程。在供應(yīng) 13CH4+NO2 -條件下，13CO2豐度顯著高于 13CH4處理，表明兩種所試土壤均發(fā)生了以 NO2 -為電子受體的厭氧 CH4氧化作用。在此底物供應(yīng)條件下，南京稻田土壤 13CO2 豐度達(dá) 4.57%～5.87%，明顯高于圍墾稻田的對(duì)應(yīng)土層(4.12%～4.69%)，暗示了南京稻田土壤可能具有較大的 NO2 -型厭氧 CH4 氧化潛力。圖 2 結(jié)果顯示，南京稻田表層(NJ10)和深層(NJ60)土壤的 CH4厭氧氧化速率分別為 3.51 和 2.45 µmol 13CO2·g-1·d-1，圍墾稻田表層(WK10)和深層(WK60)土壤的 CH4 厭氧氧化速率則分別為 1.43 和 1.36 µmol 13CO2·g-1·d-1。可以看出，南京稻田表層土壤的 CH4 氧化速率比圍墾稻田高出 59%，而深層土壤則高出 44%，表明濱海圍墾稻田的亞硝酸鹽型 CH4 厭氧速率均顯著低于內(nèi)陸南京稻田。

　　2.3 稻田土壤中 M. oxyfera 菌和總細(xì)菌的 16S rRNA 基因豐度

　　目前認(rèn)為，以 NO2 -為電子受體的 CH4 厭氧氧化過(guò)程由 NC10 門(mén)中的 M. oxyfera 細(xì)菌催化進(jìn)行。南京稻田表層中 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)為 4.82×107 copies·g-1，比深層土壤的基因拷貝數(shù)高出 1.1 倍(圖 3)。圍墾稻田表層中 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)為 2.12×107 copies·g-1，比深層土壤的基因拷貝數(shù)高出 1.4 倍。可以看出，南京稻田 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)顯著高于圍墾稻田土壤。

　　對(duì)稻田土壤總細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。其變化范圍為 2.12-3.13×108 copies·g-1，比 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)高出 1 個(gè)數(shù)量級(jí)。其中，南京稻田耕層土壤的總細(xì)菌 16S rRNA 基因拷貝數(shù)顯著高于其它三個(gè)土樣。將 M. oxyfera 細(xì)菌與總細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)相比，可得出 M. oxyfera 細(xì)菌的相對(duì)豐度。發(fā)現(xiàn)南京稻田耕層和深層土壤 M. oxyfera 細(xì)菌相對(duì)豐度為 1.5%和 0.9%，圍墾稻田則分別為 0.9%和 0.4%。

　　2.4 厭氧 CH4氧化速率與基因豐度和理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

　　對(duì)厭氧 CH4氧化速率與 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，亞硝酸型厭氧 CH4氧化速率與 M. oxyfera 細(xì)菌的 16S rRNA 基因豐度呈顯著正相關(guān)(圖 4)，說(shuō)明功能微生物的數(shù)量很大程度上決定了土壤 CH4 厭氧氧化能力。

　　對(duì)厭氧 CH4 氧化速率與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明，土壤 CH4 厭氧氧化速率與土壤 TOC、TN、NH4 +、NO3 -的含量的回歸方程均達(dá)到了顯著水平(表 2)，說(shuō)明土壤 C、N 水平是影響 CH4厭氧氧化潛力非常重要的環(huán)境要素。相反，土壤 SO4 2-含量、EC 值與厭氧 CH4 氧化速率呈負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平。值得注意的是，土壤 pH 值與厭氧 CH4 氧化速率呈負(fù)相關(guān)，且回歸方程達(dá)到了顯著水平。這些結(jié)果說(shuō)明圍墾稻田土壤的海洋性特征仍較明顯，對(duì)厭氧 CH4氧化潛力具有一定的抑制作用。

　　3 討論

　　本試驗(yàn)采用 13CH4 同位素標(biāo)記法證實(shí)了在濱海圍墾稻田和內(nèi)陸南京稻田均發(fā)生了亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用。本研究使用的 13CH4 的豐度為 99%，而且起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 10%，這樣可以最大程度地降低厭氧培養(yǎng)過(guò)程中 CH4 產(chǎn)生過(guò)程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，具有較高的可信度。而且，本厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置了只加 Ar 的對(duì)照處理，既可測(cè)試試驗(yàn)過(guò)程是否保持嚴(yán)格厭氧狀態(tài)，又可測(cè)定厭氧過(guò)程 CH4 產(chǎn)生過(guò)程特征。結(jié)果顯示，所試兩個(gè)土樣在培養(yǎng)過(guò)程中 CH4 產(chǎn)生量極低，可以忽略不計(jì)。因此，本研究采用 13CH4 同位素標(biāo)記法測(cè)出的 n-DAMO 速率能客觀真實(shí)地反映出土壤的厭氧 CH4 氧化潛勢(shì)。其中，圍墾稻田土壤的 n-DAMO 速率高于杭州灣濱海自然濕地的氧化速率(0.2～1.3 nmol 13CO2 g -1 d -1)[14]，表明圍墾植稻熟土化過(guò)程會(huì)促進(jìn)亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用。南京稻田土壤的 n-DAMO 速率與內(nèi)陸淡水濕地的氧化速率基本一致(1.8～3.6 nmol 13CO2 g -1 d -1) [7]，表明內(nèi)陸稻田與淡水濕地均表現(xiàn)出較高的 n-DAMO 速率。

　　不同土壤母質(zhì)、不同環(huán)境條件下發(fā)育形成的稻田，受理化性質(zhì)、母質(zhì)類型、農(nóng)田管理等因素影響，可能對(duì)土壤 CH4 氧化潛力產(chǎn)生重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)陸性南京稻田的亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化速率顯著高于濱海圍墾稻田。南京稻田的成土母質(zhì)為河流沉積物，黏粒比例較高，同時(shí)也形成了較為穩(wěn)定的土壤團(tuán)聚體，有利于提高土壤肥力[15]。在種植水稻過(guò)程中施 N 量和有機(jī)肥量較高，使得該所試土壤的有機(jī)碳、全氮含量較高。相反，圍墾稻田的成土母質(zhì)是長(zhǎng)江口泥沙沉積物，砂粒較粗，蓄水保肥能力差[16]，且在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中，地上部生物量小，根系生物量及分泌物量低，土壤的有機(jī)碳和 N 水平較低。本試驗(yàn)表明，土壤 TOC 和總 N 水平與厭氧 CH4 氧化速率顯著正相關(guān)，可見(jiàn)土壤本底 C、 N 水平反映了土壤的 C、N 轉(zhuǎn)化過(guò)程的基本特征，對(duì)土壤厭氧 CH4 氧化潛力有著極其重要的影響。這與 Shen 等[14]的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為濕地土壤硝化和反硝化作用強(qiáng)烈，其中間產(chǎn)物 NO2 -可以為 M.oxyfera 菌提供底物促進(jìn) CH4 氧化過(guò)程。而且南京稻田中 TOC 含量高，可為反硝化微生物提供較多碳源，促進(jìn)反硝化作用，有利于為 M.oxyfera 菌提供底物 NO2 -。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，n-DAMO 速率與土壤 EC 值、SO4 2-含量均呈顯著負(fù)相關(guān)。這與 Wang 等[10]的結(jié)果一致。圍墾稻田土壤中 SO4 2-含量比南京稻田高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，EC 值也顯著高于南京稻田，這些海洋性特征參數(shù)可能也是造成圍墾稻田厭氧 CH4 氧化速率低的重要原因。這與 Li 等[13]的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為，較高的鹽度會(huì)導(dǎo)致 n-DAMO 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)較高的滲透壓，不利于細(xì)胞新陳代謝;而且鹽度高會(huì)直接抑制亞硝酸還原酶、一氧化氮歧化酶的活性[17]。不僅如此，較高的 SO4 2-含量本身可以作為電子供體，介導(dǎo)硫酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用，對(duì)亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化過(guò)程具有抑制效應(yīng)[18]。

　　本試驗(yàn)中，圍墾稻田土壤 M.oxyfera-like 細(xì)菌的 16S rRNA 基因拷貝數(shù)為 (0.89～2.12)×107 copies·g-1，其變化范圍與杭州灣濱海和長(zhǎng)江口灘涂濕地的數(shù)量級(jí)一致[10,14]，且顯著低于南京稻田。不僅如此，M.oxyfera-like 細(xì)菌的相對(duì)豐度也表現(xiàn)為圍墾稻田明顯低于南京稻田。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，M.oxyfera-like 細(xì)菌的基因拷貝數(shù)與 n-DAMO 速率、土壤總氮和礦質(zhì)態(tài)氮均呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明 M.oxyfera-like 細(xì)菌的數(shù)量及其活性等生物學(xué)特性是導(dǎo)致 n-DAMO 速率產(chǎn)生空間變異的主控因素。然而，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，內(nèi)陸湖泊沉積物中，M.oxyfera-like 細(xì)菌的基因拷貝數(shù)與土壤 TOC、總氮和礦質(zhì)態(tài)氮均呈顯著負(fù)相關(guān)，暗示除了土壤理化性質(zhì)之外，可能還受到其它因素的重要影響，如厭氧氨氧化菌的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)等。說(shuō)明 M.oxyfera-like 細(xì)菌在不同類型土壤中分布規(guī)律不盡相同，受控因素較多，有待深入研究。

　　本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種類型的稻田中耕層土壤的厭氧 CH4 氧化速率均顯著高于深層土壤。此前在旱地農(nóng)田和西溪濕地的研究中也有類似的報(bào)道。而且，本研究還發(fā)現(xiàn) M.oxyfera-like 細(xì)菌的豐度表現(xiàn)未表層遠(yuǎn)高于深層土壤。在之前的稻田土壤中也有報(bào)道 M.oxyfera-like 細(xì)菌僅分布在深層土壤中而在表層土壤中未能檢測(cè)到[12]。現(xiàn)已證實(shí)，M.oxyfera-like 細(xì)菌是嚴(yán)格厭氧類型，其自身可以內(nèi)產(chǎn)氧方式滿足 CH4 氧化過(guò)程[19]，而環(huán)境氧分壓對(duì)其會(huì)有強(qiáng)烈抑制作用，體積分?jǐn)?shù)為2%的氧氣可促使 n-DAMO 細(xì)菌失去活性。照此推測(cè)，分布在濕地深處的土層其厭氧 CH4 氧化潛力應(yīng)高于表層土壤。例如，白洋淀湖泊沉積物中 M.oxyferalike 細(xì)菌豐度隨著深度增加有明顯的增加趨勢(shì)[20]。在杭州稻田的研究也有類似報(bào)道[7]。然而，對(duì)嘉興稻田 M.oxyfera-like 細(xì)菌的研究顯示，其表層(0～40 cm)豐度遠(yuǎn)高于深層(40～100 cm)豐度[12]。除了氧分壓之外，亞硝酸型厭氧 CH4 氧化作用還受到許多其它因素的影響，如 CH4 底物濃度、NO2 -底物濃度、反硝化速率等。稻田耕層根系分布密度大，根際分泌物多，是稻田 CH4 產(chǎn)生的主要生境[21]。這種高分壓 CH4濃度是 CH4氧化微生物的重要底物，對(duì)亞硝酸型厭氧 CH4 氧化過(guò)程可能具有重要的促進(jìn)作用。不僅如此，施加的 N 肥大部分進(jìn)入稻田耕層，進(jìn)行強(qiáng)烈的硝化和反硝化作用，在耕層會(huì)產(chǎn)生較多的 NOx -等中間產(chǎn)物，有利于 M.oxyfera-like 細(xì)菌獲取 NO2 -底物。研究發(fā)現(xiàn)，從熱力學(xué)角度來(lái)看， M.oxyfera-like 細(xì)菌介導(dǎo)的甲烷厭氧化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)自由能釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于反硝化菌介導(dǎo)的反硝化過(guò)程，在 NOx -等比較豐富而耕層稻田中其反硝化菌對(duì) M.oxyfera-like 細(xì)菌的抑制作用較小，有利于亞硝酸型厭氧 CH4 氧化作用的進(jìn)行，相反，在深層土壤中 NOx -等相對(duì)貧乏，M.oxyfera-like 細(xì)菌會(huì)收到反硝化微生物的強(qiáng)烈抑制，從而使得 NO2 -為底物的甲烷厭氧氧化速率減小。因此，本試驗(yàn)中，土壤 TOC、N 水平對(duì)亞硝酸型厭氧 CH4氧化作用起著主導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致其耕層土壤的氧化速率顯著高于深層土壤。

　　pH 值是影響土壤厭氧 CH4 氧化作用的重要因素[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。He 等[23]考察了不同 pH 條件下 M.oxyfera 細(xì)菌的甲烷氧化活性，發(fā)現(xiàn)其最適 pH 值是 7.6，暗示了該菌偏好弱堿性環(huán)境。本試驗(yàn)中圍墾稻田土壤 pH 值盡管呈弱堿性，但是厭氧 CH4 速率遠(yuǎn)低于南京稻田，可能的原因是土壤中高濃度的 SO4 2-離子也可作為電子受體參與甲烷厭氧氧化，具有底物競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)[18]。而且土壤本底 N 水平低，N 轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的 NO2 -較少，在一定程度上也抑制了亞硝酸型厭氧 CH4氧化過(guò)程。

　　需要指出的是，稻田土壤 CH4 轉(zhuǎn)化過(guò)程及功能微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到諸多因素的影響，如水稻生育期、施肥量、農(nóng)田管理等。本研究選取了兩種不同類型的典型稻田進(jìn)行比較，僅能代表所試稻田土壤的厭氧 CH4 氧化潛勢(shì)。在此基礎(chǔ)上，需要從不同氣候帶采集更多不同類型的稻田土壤，深入研究典型稻田厭氧 CH4 氧化作用的本質(zhì)特征，為探索我國(guó)稻田溫室氣體減排措施提供科學(xué)依據(jù)。

　　4 結(jié)論

　　1)內(nèi)陸性稻田土壤厭氧 CH4氧化速率顯著高于濱海圍墾稻田，其土壤 C、 N 水平和功能微生物豐度是造成兩種類型稻田產(chǎn)生差異的主要原因。

　　2)兩種類型稻田中，耕層土壤的厭氧 CH4氧化速率顯著高于深層土壤，其耕層土壤中功能微生物豐度高、活性氮豐富是 CH4氧化潛力較高的重要原因。