PQQ誘導水稻對紋枯病的抗性研究

　　摘　要：為篩選出誘導水稻對紋枯病抗性的最佳誘導因子及其誘導最佳條件，在水稻苗期分別噴施不同濃度苯并噻二唑(BTH)、殼寡糖(COS)、吡咯喹啉醌(PQQ)、前胡提取液、益農和翆倍加，開展不同誘導因子及誘導方式對水稻紋枯病抗性影響研究。通過調查發病度，計算病情指數和相對防效，篩選出最佳誘導因子及其誘導條件(濃度、方式、誘導時間)。結果表明，BTH、COS、PQQ、前胡提取液、益農和翆倍加均能減輕紋枯病的發生，其中以濃度為 2.0 μmol/L 的 PQQ 處理防治效果最好，相對防效達到 51.0%，遠高于其他誘導因子的相對防效，也顯著優于對照井岡霉素。PQQ 誘導作用的最優條件為苗期噴施、濃度 2.0 μmol/L、誘導時間 72 h，其相對防效可達 50% 以上。

　　本文源自歐陽茹; 李巳夫; 魯湘; 劉洋; 歐陽翔; 張玉燭， 雜交水稻 發表時間：2021-05-27《雜交水稻》雜志，于1986年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:43-1137/S，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：、新組合、簡訊 、國外動態等。

　　關鍵詞：吡咯喹啉醌;水稻紋枯病;誘導抗病性

　　紋枯病是世界性的水稻病害，平均每年造成水稻減產 10% ～ 20%，嚴重時減產高達 45%[1]。該病在中國各稻區均有分布，特別是長江以南稻區發病嚴重 [2]。近年來，過量施用氮肥、矮稈密植的高產栽培模式導致水稻紋枯病的危害愈發嚴重 [3]。目前生產中缺少免疫和高抗紋枯病水稻品種，對于紋枯病的防治以化學藥劑為主 [4]，但長時間使用易導致病原菌產生抗藥性，迫使化學藥劑用量不斷增加，對農業生態環境造成嚴重污染。因此，迫切需要低污染高防效的紋枯病防治新方法，以保證水稻的穩產高產和環境安全。植物經過與病原體的長期協同進化，會激發一系列的防衛機制抵御病原體的侵害，植物在未受脅迫時防衛機制不會啟動，而在物理、化學和生物等誘導因子的作用下，植物自身的防衛機制被激發，進而增強對病害的抗性，這種方法叫做植物誘導抗病性 [5]。通過利用植物本身的抗性機制來防治病害，是一種經濟有效且對環境安全的防治措施，可能有效解決目前防治水稻紋枯病的困境。

　　植物誘導抗病性現已應用于植物病害防治，許多誘導因子被證實能夠誘導植物抗病性，如水楊酸(SA)、乙烯、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、硅(Si)、前胡提取液、二氯環丙烷、2,6- 二氯異煙酸(INA)、草酸、磷酸鹽、苯并噻二唑(BTH)、殼寡糖(COS)、褪黑素(MT)和茉莉酸甲酯(MeJA)等 [6-8]。其中前胡提取液被證實能有效提高水稻抗瘟性 [9]，MT 對小豆抗銹病誘導防效達 61.05%[10]，SA、INA、BTH 均可以誘導小麥產生對葉銹病、白粉病、赤霉病等多種病害的廣譜抗性 [11]，ABA 溶液處理水稻的種子與幼苗可以顯著提高水稻對立枯病的抗病性 [12]。誘導因子硅、乙烯、JA、BTH、COS 均能夠誘導水稻對紋枯病抗性，有效減少水稻紋枯病的發生。硅能夠提高水稻對稻瘟病、稻曲病、紋枯病、白葉枯病等多種病害的抵抗力 [13]，而 BTH 是第 1 個成功商品化的誘導劑，也是最早應用于水稻紋枯病防治的誘導劑 [14]。白春微研究表明 0.75 mmol/L 的 BTH 和 50 μg/mL 的 COS 均能誘導水稻對紋枯病抗性 [15]。鐘慶燕研究則認為 0.2 mmol/L 的乙烯和 0.1 mmol/L 的 JA 處理對水稻紋枯病具有明顯誘導抗性 [16]。目前多種植物誘導劑已經商品化，如阿泰靈、碧護、煙望素和抗病豐等。植物誘導抗病性具有抗性穩定、持久、環保等優點 [17]，在植物病害防治方面具有重大應用和潛在價值。

　　雖然多種誘導因子均能誘導水稻對紋枯病抗性，但誘導效果存在差異。本文以易感紋枯病水稻品種 Lemont 為研究對象，在水稻 3 葉 1 心期分別噴施不同濃度誘導因子，接種紋枯病后調查病情指數和相對防效，篩選出最佳的誘導因子。在最佳誘導因子處理下，分別采用浸種、浸根、噴施 3 種誘導方式處理水稻，不同時間誘導處理水稻，以確定最佳誘導因子的最佳誘導條件(濃度、方式、誘導時間)，以期為植物誘導抗病的田間應用及水稻紋枯病抗性誘導機理提供一定理論及技術支撐，為綠色高效防治水稻紋枯病提供新思路。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　供試水稻品種：Lemont。供試紋枯病菌菌株： C30 菌種，由湖南省水稻研究所李小湘研究員提供。供試藥劑：苯并噻二唑(簡稱 BTH)化學純 CP(98%)，由阿拉丁試劑(上海)有限公司生產;殼寡糖(簡稱 COS)分析純 AR，由東京化成工業株式會社生產;吡咯喹啉醌(簡稱 PQQ)，由上海醫學生命科學研究中心提供;前胡提取液，由湖南農業大學植物保護學院羅坤老師提供;益農、翆倍加，由湖南省農科院植物保護研究所光合細菌課題組提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　水稻培育和接種方法

　　將水稻種子用 1% 的次氯酸鈉消毒 20 min，再用無菌水沖洗掉殘留的次氯酸鈉，浸種 24 h 后置于溫度 30 ℃下催芽 48 h，選取萌發一致的種子播種于 96 孔播種板上。水培營養液配方參照國際水稻研究所(IRRI)推薦的標準，培養條件溫度為 14 h 30 ℃ /10 h 28 ℃，濕度為 70%，光照強度為 14 h 20 000 lx/10 h 0lx。

　　挑選大小一致的紋枯病菌菌核(約 1 mm)，用消毒后的鑷子輕輕拉開水稻的不完全葉的葉鞘，將菌核放在葉鞘上，接種后將水培盒用保鮮膜罩住保持濕度，培養濕度由 70% 改為 92%，其他培養條件與培育條件一致。病情調查參考行業標準NY/T 2720—2015 水稻抗紋枯病鑒定技術規范。

　　發病度 =(病斑高度 / 苗挺高)9。具體分級為： 0 級—全株無病;1 級—0 < 發病度≤ 1.0;3 級— 1.0 < 發病度≤ 3.0;5 級—3.0 < 發病度≤ 5.0; 7 級—5.0 < 發病度≤ 7.0;9 級—>7.0< 發病度。

　　病情指數 DI= ∑ (Bi×Bd) M×9 ×100。式中，Bi—各級病株數;Bd—病情級別數;M—總株數。相對防效 = 對照病情指數 - 處理病情指數對照病情指數 ×100%。

　　1.2.2　誘抗物的篩選

　　稱 取 1.361 7 g BTH 于 50 mL 甲 醇 中， 充分溶解配制成濃度為 0.2 mol/L 母液，分別量取 25.0、50.0、250.0、500.0 μL 的 BTH 母液于去離子水中，使其終濃度分別為 50.0、100.0、500.0、 1 000.0 μmol/L;稱取 2.5 g COS 于 50 mL 去離子水中，充分溶解配制成濃度為 50 mg/mL 母液，分別量取 20.0、100.0、200.0、2 000.0 μL 的 COS 母液于去離子水中，使其終濃度分別為 10.0、 50.0、100.0、1 000.0 μg/mL;稱取 0.074 8 g PQQ 于 50 mL 去離子水中，充分溶解配制成濃度為 4.0 mmol/L 母液，分別量取 12.5、50.0、200.0、 500.0 μL 的 PQQ 母液于去離子水中，使其終濃度分別為 0.5、2.0、8.0、20.0 μmol/L;將前胡提取液分別稀釋 25、50、100、200 倍;將益農分別稀釋 200、300、400、500 倍;將翆倍加分別稀釋 200、300、400、500 倍。

　　待水稻長至 3 葉 1 心期分別噴施不同濃度的誘導因子，同時噴施清水、井岡霉素作為對照。噴施方法采用噴霧塔噴霧，參數設置為：96 mm/r、行走距離 1 200 mm、前進速度 482 mm/s、回零點速度 150 mm/s。噴施 72 h 后接種紋枯病菌。接種菌核 120 h 后調查發病度。

　　1.2.3　不同濃度 PQQ 處理紋枯病菌

　　將過濾滅菌的 PQQ 加入已滅菌的 PDA 培養基中，使培養基中 PQQ 的終濃度分別為 0.5、1.0、 2.0、4.0、8.0 μmol/L，對照為正常的 PDA 培養基。待培養基平板冷卻后，用滅菌的鑷子夾取直徑為 1 mm 的紋枯病菌菌核接種于平板中央，28 ℃光照培養 24 和 48 h 后測量菌落直徑。

　　1.2.4 PQQ 最佳誘導方式的篩選

　　浸種：將消毒后的水稻種子浸泡在濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的 PQQ 溶液中 24 h，清水浸泡作為對照，正常催芽、播種，待水稻長至 3 葉 1 心時接種紋枯病菌，接種菌核 120 h 后調查發病度。

　　浸根：正常浸種、催芽、播種，待水稻長至 3 葉 1 心期，向水培液中加入 PQQ 使水培液中 PQQ 濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L，正常水培液培養作為對照。培養處理 72 h 后接種紋枯病菌，接種菌核 120 h 后調查發病度。

　　噴施：正常浸種、催芽、播種，待水稻長至 3 葉 1 心期進行 PQQ 噴施，噴施濃度為 0.5、1.0、 2.0、4.0、8.0 μmol/L，清水噴施作為對照。噴施方式與 1.2.2 一致，噴施 72 h 后接種紋枯病菌，接種菌核 120 h 后調查發病度。

　　不同誘導時間：正常浸種、催芽、播種，在水稻 3 葉 1 心期分別噴施濃度為 2.0 μmol/L 的 PQQ 和 清 水， 在 噴 施 24、48、72、96、120、 144 h 后分別接種水稻紋枯病菌，接種菌核 120 h 后調查發病情況。

　　1.2.5　數據處理

　　試驗數據采用 Microsoft Excel 2010 軟件進行處理，采用 SPSS 22.0 軟件進行差異顯著性分析，雙因素方差分析圖采用 R 語言的 HH 包分析，使用 GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖。

　　2　結果與分析

　　2.1　誘抗物的篩選

　　通過不同濃度誘導因子處理水稻發現 BTH、 COS、PQQ、前胡提取液、益農、翆倍加均能誘導水稻對紋枯病抗性，紋枯病的發生均有不同程度的減輕(表 1)。BTH 處理的相對防效均低于 25.0%;COS 處理中只有濃度 50.0 μg/L 的相對防效大于 30.0%，其余濃度處理的相對防效均低于 15.0%;PQQ 處理中除濃度 20.0 μmol/L 的相對防效低于 15.0%，其他濃度處理的相對防效均高于 25.0%;前胡提取液處理中稀釋 100 倍的相對防效大于 35.0%，其余濃度處理相對防效均低于 20.0%;翆倍加處理的相對防效均低于 25.0%;益農處理中只有稀釋 300 倍的相對防效大于30.0%，其余濃度處理相對防效均低于 25.0%。

　　不同誘導因子均存在各自的最適處理濃度。 BTH、COS、PQQ、前胡提取液、益農和翆倍加的最適處理濃度分別為 500.0 μmol/L、50.0 μg/L、 2.0 μmol/L、稀釋 100 倍、稀釋 400 倍和稀釋 300 倍(表 1)。不同誘導因子最適濃度處理間的相對防效存在差異(圖 1)，最適處理濃度相對防效最低的誘導因子為 BTH 和益農，相對防效分別為 22.8% 和 23.1%;前胡提取液、翆倍加和 COS 最適處理濃度的相對防效分別為 36.2%、34.2% 和 30.1%，而 PQQ 最適處理濃度的相對防效達到 51.0%，明顯高于其他誘導因子的相對防效，同時也明顯優于對照井岡霉素的相對防效(46.3%)。表明 PQQ 為本試驗中的最佳誘導因子。

　　2.2 PQQ 對紋枯病菌菌絲生長的影響

　　通過不同濃度 PQQ 處理紋枯病菌發現 PQQ 對紋枯病菌菌絲生長沒有抑制作用(圖 2)。在不同濃度 PQQ 處理 24 h 后，濃度 2.0、4.0、8.0 μmol/L 處理的菌核均可正常萌發且菌落直徑均大于空白處理，但與空白無顯著性差異;處理 48 h 后，濃度 2.0、4.0、8.0 μmol/L 處理的菌落直徑均顯著大于空白處理，說明 PQQ 對水稻紋枯病菌菌絲生長沒有抑制作用，在高濃度處理下甚至會促進菌絲生長。PQQ 可能是直接作用于水稻，誘導水稻對紋枯病抗性，激發水稻自身免疫系統，提高水稻抗逆性，從而減輕水稻紋枯病的發生。

　　2.3 PQQ 誘導方式對誘導效果的影響

　　浸種、浸根和噴施 3 種誘導方式均可降低水稻紋枯病的發生(表 2)，其中以 3 葉 1 心期地上部噴施 PQQ 的誘導方式防治效果最好，浸種次之，浸根效果最差，不同誘導方式處理間差異達到極顯著水平(p<0.01)(圖 3)。誘導方式和處理濃度之間并無交互作用，影響病情指數的主因為誘導方式，濃度處理影響較小。從圖 3 可以看出 3 種誘導方式的病情指數隨濃度變化趨勢一致，隨著濃度升高病情指數明顯降低，2.0 μmol/L 時病情指數達到最低，而濃度繼續增加導致病情指數呈升高趨勢。說明 PQQ 誘導水稻對紋枯病抗性存在最適濃度范圍。浸種和噴施處理的最佳作用濃度均為 2.0 μmol/L，浸種處理的病情指數為 35.55%，相對防效為 43.68%;噴施處理的病情指數為 31.86%，相對防效達到了 49.57%。浸根處理濃度間沒有明顯差異，但病情指數最低的處理濃度為 4.0 μmol/L，相對防效為 17.91%。表明 PQQ 最適的誘導方式為噴施，最適噴施濃度為 2.0 μmol/L。

　　不同誘導時間處理下，誘導 48、72、96、 120、144 h 后的水稻病情指數均低于空白對照(圖 4)，其中 48、72、96、120、144 h 的處理病情指數均顯著(p<0.05)低于空白對照。說明 PQQ 誘導水稻對紋枯病抗性能持續 144 h 以上。病情指數隨誘導時間的增加呈先降后升的趨勢。PQQ 噴施 24 h 后相對防效幾乎為 0，隨著誘導時間增加，病情指數逐漸降低，處理 72 h 后病情指數最低，相對防效達到 50% 以上，噴施 96 h 后病情指數逐漸上升。表明 PQQ 需要一定時間才能誘導水稻產生紋枯病抗性，并且存在最佳的誘導時間，PQQ 誘導處理 72 h 后對水稻紋枯病的防治效果最好。

　　3　討論

　　紋枯病作為水稻三大病害之一，近年來發病范圍擴大且發病程度愈發嚴重，是水稻減產的重要原因之一。實際生產缺少免疫和抗性品種，對于紋枯病的防治以化學藥劑為主，但長期使用會對生態環境造成不可逆轉的破壞，而植物誘導抗病性可以通過植物本身的抗性機制來防治病害，是一種經濟有效且對環境安全的防治措施，能夠兼顧病害防治與環境安全問題。本試驗篩選出的最佳誘導因子 PQQ 在水稻苗期相對防效可達 51.0%，遠高于其他誘導因子的相對防效，顯著優于對照井岡霉素，為 PQQ 的田間應用提供了技術及理論支撐，也為綠色高效防治水稻紋枯病提供新思路。

　　3.1　不同誘導因子對紋枯病誘導效果的影響

　　目前，誘導因子已被作為農藥的替代品成功應用于植物病害防控，BTH、COS 是最早發現并用于植物病害防治的誘導因子 [14,18]，但在本研究中這兩種誘導因子表現較差。這主要是因為植物誘導抗病雖具有廣譜抗性 [19]，但不同致病菌致病力有差異，不同水稻品種間抗病性也存在差異，這就導致同一種誘導因子在誘導不同水稻品種抗性時存在差異。前人對于誘導因子誘導效果的討論通常只針對 1 個水稻品種或 1 種水稻紋枯病菌，對于誘導因子對水稻紋枯病的廣適性研究還鮮有報道，這也是植物誘導抗病性難以大規模推廣的重要原因之一。

　　前胡提取液被證實能夠誘導水稻對稻瘟病抗性且有較好的防治效果 [9]，但在水稻紋枯病抗性誘導方面還未有報道，本研究中前胡提取液誘導效果并不理想。稻瘟病菌是活體營養性病害，植物通過水楊酸信號途徑以激活系統獲得性抗性(SAR)，但紋枯病屬于死體營養性真菌，植物抵御死體營養性真菌主要通過響應茉莉酸信號途徑引發誘導系統抗病性(ISR)[16,20]。對于不同病菌類型，植物響應機制不同，導致同一誘導因子防治效果存在差異，這可能是本研究中前胡提取液誘導水稻對紋枯病抗性效果較差的主要原因。

　　PQQ 具有抗氧化應激、促動植物生長發育的生物學功能 [21-22]。在冷脅迫條件下，PQQ 可以促進 SOD、APX 酶活性升高和抑制 GSH 含量的下降，從而減輕低溫脅迫對黃瓜幼苗的傷害 [23]。杜陽 [24] 研究表明 PQQ 在 1 000 μmol/L 濃度下能顯著降低四尾柵藻在 H2O2 脅迫下的氧化損傷。李鑫等 [25] 研究認為噴施 200 nmol/L 的 PQQ 能顯著提高辣椒的耐旱能力。本研究也表明 PQQ 能夠顯著降低紋枯病菌對植株的損傷。這表明 PQQ 在植物抗性誘導方面具有重要作用，但其誘導水稻紋枯病抗性的生理和分子機制尚不清楚，需要進一步深入研究。

　　目前，利用微生物高效合成 PQQ 已有大量報道 [26-27]，而 PQQ 與微生物互作的研究卻鮮有報道。本研究表明 PQQ 對紋枯病菌菌絲生長沒有抑制作用，甚至在中高濃度下會促進紋枯病菌菌絲的生長。這可能是因為高濃度 PQQ 成為了病菌的碳源從而促進其菌絲生長，這其中的作用機制值得進一步探討，PQQ 可能是通過提高植物本身抗性從而減輕紋枯病的發生，而非抑制紋枯病菌菌絲的生長。

　　3.2　不同誘導方式對紋枯病誘導效果的影響

　　本研究對比了噴施、浸種、浸根3種誘導方式，發現 PQQ 最優的誘導方式為葉面噴施，浸種次之，浸根處理效果不顯著。李鑫等 [28] 研究也表明，PQQ 噴施處理相較于灌根更有利于辣椒生長，這可能與 PQQ 的作用機制有關。研究認為，PQQ 一般通過影響相關基因的表達而增加抗氧化酶的總量，減少動植物體內活性氧、自由基的含量，從而促進動植物的生長發育 [23]。水稻根部可能少量存在或不存在 PQQ 作用的受體，導致浸根處理效果不明顯，這可能也是 PQQ 不同誘導方式的防治效果存在差異的原因。劉衛群等 [29] 研究表明， PQQ 能夠提高煙草種子萌發率，使脂肪酶活性和種子呼吸速率升高。楊雪鵬等 [30] 發現 PQQ 具有促進水芹種子萌發的生理效應。本研究也發現浸種處理的水稻種子較對照發芽率更高且抗病性更好，浸種處理最高防效可達 43.0% 以上。噴施與浸種處理均有較好的防治效果，如同時對水稻進行噴施與浸種處理，是否具有更好的防治效果，還需要進一步試驗。

　　本研究發現不同誘導時間處理間的防治效果存在差異，PQQ 誘導處理 24 h 的相對防效幾乎為 0，本試驗證實 PQQ 至少需要 24 h 才能夠激發水稻自身的防衛機制，并在 72 h 達到高峰。這與白春微 [15] 的研究結果一致。李張 [19] 的研究結果表明，農抗 211 誘導水稻紋枯病抗性作用最佳時期為噴施藥液后 48 至 96 h。這表明誘導因子誘導植物抗性不會在處理后立刻表達，需要 24 h 以上或更長時間才能誘導植物表達抗病性。

　　3.3 PQQ 的應用前景

　　目前水稻紋枯病的防治還是以井岡霉素等藥劑為主，這些化學藥劑雖被證實對人體健康無毒副作用，但對糧食和環境安全性存在潛在危害，無法做到綠色安全的防治紋枯病。PQQ 作為新型輔基，已經應用在神經營養、心臟保護、抗癌治療、調節免疫功能等方面，對微生物、動植物具有廣泛的營養作用 [31-32]，市場上已將 PQQ 作為營養補充劑售賣 [33]。將 PQQ 應用于植物病害防治，對人體健康無毒副作用，同時可以保證糧食和環境的安全性，不存在潛在危害，真正做到綠色高效防治紋枯病，且 PQQ 兼具微量高效、方便快捷和易于取得的特點，在植物病害防治方面具有重大的應用價值。Ho 等 [34] 研究也表明，能產生吡咯硝菌素和吡咯并喹啉醌的內生菌可以作為生物防治劑用于枯萎鐮刀菌的生物防治和植物推廣。本研究首次將 PQQ 應用于水稻紋枯病防治，得到了顯著的防治效果。在水稻3葉1心期噴施2.0 μmol/L 的 PQQ 誘導 72 h 能顯著提高水稻對紋枯病抗性，減輕發病程度，有效防治水稻紋枯病的發生。這不僅表明了 PQQ 在植物生長和抗逆方面的巨大潛能，也為防治水稻紋枯病提供了新思路。本文只研究了 PQQ 對水稻苗期紋枯病的防治效果，而紋枯病多發于水稻分蘗末期和灌漿期，對于田間應用的效果及作用條件還需進一步開展研究。