不同氮肥對西南蠟梅幼苗生長及根際土壤細菌群落的影響

　　摘要：以盆栽西南蠟梅為試材,對西南蠟梅種植土壤施用不同氮肥(CK、N1(NH4NO3)、N2(KNO3)、N3(C2H5NO2)、N4(NH4Cl)),采用熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳技術,研究不同氮肥對西南蠟梅根際土壤細菌群落的影響,分析其理化性質、土壤細菌群落及植物生長的關系,以期為西南蠟梅推廣栽培、科學施肥和保護土壤生態系統提供參考依據。結果表明:氮肥處理后植株株高和干質量均高于CK,且均為N1最高;qPCR結果顯示,與CK相比,N1的根際細菌拷貝數最高;DGGE圖譜分析顯示,氮肥處理后的土壤細菌多樣性指數均大于對照;相關性分析表明,細菌拷貝數及多樣性指數均與西南蠟梅幼苗植株生長呈極顯著相關(P<0.01)。綜合分析,不同氮肥處理對植株生長發育和土壤微生物數量及群落結構影響明顯,施NH4NO3對盆栽西南蠟梅幼苗植株生長發育及根際土壤細菌拷貝數、多樣性指數促進作用最好。

　　本文源自北方園藝,2020(19):86-93.《北方園藝》是由黑龍江省農科院主管、黑龍江省園藝學會和黑龍江省農科院主辦的以科學研究和技術普及相結合的園藝類綜合性科技期刊。創刊于1977年，國內外公開發行。本刊多年來已形成了自己的辦刊特色，受到全國農業科研、教學、生產第一線等科技人員和廣大讀者的熱情支持和歡迎，既是科技人員技術交流和發布佳篇新作的信息平臺，也是園藝種植戶的致富幫手和秘籍錦囊。

　　氮肥對植物生長至關重要,氮素是植物生長發育所必需的大量營養元素,其中NO-3-N和NH+4-N是植物主要吸收的氮素形態,而尿素和氨基酸等有機氮也可被植物吸收[1]。不同氮肥對植物生長存在著不同影響,研究發現與硝態氮相比,施用銨態氮對尾赤桉(E.uophylla×E.camaldulensis)幼苗株高、水稻(Oryzasativa)幼苗干鮮質量的促進效果更好[2,3],而施用硝態氮對菠菜(Spinaciaoleracea)和黃檗(Phellodendronamurense)幼苗的株高[4,5]、小白菜(Brassicachinensis)地上部分及根的干鮮質量有促進作用[6]。不同的研究結果顯示,相比銨態氮和硝態氮,施用甘氨酸對紅松(Pinuskoraiensis)幼苗的株高和干質量促進最明顯[7]。另外,研究表明以硝態氮和銨態氮混合施肥對生長影響也不同,如張雪等[8]和許楠等[9]發現,與施用單一氮素相比,氮素為NO-3∶NH+4=1∶1時,對黃瓜(CucumissativusL.)幼苗的干鮮質量和桑樹(MorusalbacvQinglong)幼苗的干鮮質量、株高促進作用最明顯,但康曉育等[10]卻發現單獨施用銨態氮和硝態氮后的平邑甜茶(M.hupehensis(pamp)Rehd)干鮮質量均明顯高于銨態氮+硝態氮處理。

　　細菌是土壤中含量最多、豐富度最高和分布最廣泛的微生物類群,通常占土壤微生物的70%～90%,能有效促進有機質分解、營養物質的釋放,在土壤生態過程中有著不可或缺的地位[11,12]。土壤細菌對外界干擾比較敏感,是土壤生態系統變化的預警指標,常用于評價土壤生態系統的健康程度。施用氮肥對土壤細菌影響存在差異,研究發現,與施用硝態氮和有機氮肥相比,施用銨態氮對紅菜薹(Brassicarapa)幼苗根際土壤細菌數量促進作用更明顯[13],而不同研究結果顯示硝態氮對豫麥50(TriticumaestivumL.)的根際土壤細菌數量促進作用更好[14]。不同氮肥對土壤微生物多樣性也會產生差異,研究發現,與不施肥相比,有機氮(甘氨酸)對苗期的大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)土壤微生物多樣性具有促進作用,但銨態氮和硝態氮處理對多樣性均為抑制作用[15],而不同的研究結果顯示銨態氮、硝態氮和有機氮(甘氨酸)對番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗根際土壤微生物均有促進作用[16]。因此,研究氮肥對植物根際土壤微生物群落的影響能為建立合理施肥制度、提高土壤肥力和實現土壤可持續利用提供科學依據。

　　西南蠟梅(Chimonanthuscampanulatus)是我國西南地區特有品種,野生狀態下分布于云南祿勸、麻栗坡及貴州南部等地[17]。目前對西南蠟梅的人工栽植培育研究相對較少,不利于西南蠟梅的栽培及資源開發與利用。該試驗通過研究不同氮肥施用對盆栽西南蠟梅生長、土壤理化性質和根際土壤細菌群落的影響,比較分析西南蠟梅生長、土壤理化性質和根際土壤細菌群落間之間的關系,明確西南蠟梅生長對氮肥吸收的特性,為西南蠟梅推廣栽培、科學施肥和改善土壤生態系統提供借鑒。

　　1、材料與方法

　　1.1試驗地概況

　　試驗地位于云南省昆明市盤龍區西南林業大學后山樹木園(東經10°46′,北緯25°04′),屬北亞熱帶低緯高原山地季風氣候,年平均氣溫16.5℃,年均降雨量1450mm。

　　1.2試驗材料

　　供試材料為西南蠟梅種子(采自昆明黑龍潭公園),栽培土壤為紅壤,土壤基本理化性質為:有機質含量1.024%,pH6.77,電導率375.8μS·cm-1,銨態氮含量0.362mg·kg-1,硝態氮含量3.485mg·kg-1,全氮含量1.040g·kg-1,全磷含量2.203mg·kg-1,全鉀含量20.385mg·kg-1,土壤經5mm鋼篩過篩后混勻,裝入栽培盆中(口徑16cm×高度14cm),每盆均裝土1kg。種子于2018年6月播種于育苗盆中。

　　1.3試驗方法

　　待長出4片真葉時,選取長勢一致的幼苗進行處理。試驗設置5個處理,以不施用氮肥的幼苗為對照(CK),氮素處理分別為NH4NO3(N1)、KNO3(N2)、C2H5NO2(N3)和NH4Cl(N4)。濃度配比方法,稱取0.0800gNH4NO3、0.1011gKNO3、0.0751gC2H5NO2及0.0535gNH4Cl分別溶于50mL純水中,氮素濃度均為20mmol·L-1,每處理3次重復。施用方法,取50mL處理溶液(對照用50mL純水代替)沿幼苗基部周圍緩慢倒入育苗盆中。

　　施肥后,15d和30d各取一次樣,采用抖根法獲取西南蠟梅根系上黏附的土壤作為根際土壤,過篩后用液氮速凍,置于-80℃保存備用。同時,取完整植株樣品,編號后待用。

　　表15種氮素形式施肥處理

　　1.4項目測定

　　1.4.1樣品理化性質測定

　　土壤樣品:采用1∶5土水比法測定pH和電導率;采用2mol·L-1KCl浸提-靛酚藍比色法測定銨態氮;采用雙波長紫外分光光度法測定硝態氮;取5g過篩新鮮土,烘干48h后測定干質量。

　　植株樣品:利用直尺測量株高(植株在土壤以上主莖至主莖頂芽基部之間的長度);植株烘干48h后測定干質量。

　　1.4.2土壤DNA提取和PCR擴增

　　用E.Z.N.A.SoilDNAKit(OMEGA,上海)試劑盒提取和純化土壤總DNA,具體操作參照說明書。PCR反應體系為50μL,包括:模板DNA1μL、10μmol·L-1正反向引物各1μL、ExTaqDNA聚合酶(Takara,大連)25μL、ddH2O22μL。細菌特異性引物序列和反應條件見表2。

　　1.4.3土壤細菌16SrDNA基因的熒光定量PCR

　　采用實時熒光定量PCR儀(LightCycler480Ⅱ,瑞士)進行熒光定量分析,qPCR引物及反應條件見表2。選取含有目的基因片段的質粒,梯度濃度稀釋后,進行標準曲線的繪制。質粒和樣品qPCR反應體系為20μL:模板DNA1μL、10μmol·L-1正反向引物各0.5μL、TBGreenPremixExTaqⅡ(Takara,大連)10μL、ddH2O8μL。每個樣品設3個重復。標準曲線的R2為0.992,擴增效率為96.83%。結合標準曲線,根據Cp值進行細菌拷貝數的計算。

　　表2PCR和qPCR擴增引物及反應條件

　　1.4.4變性梯度凝膠電泳(DGGE)

　　DGGE分析采用D-Code基因突變檢測系統(Bio-RadLaboratoriesInc,USA)對擴增后的PCR產物進行分析,凝膠濃度采用8%的聚丙烯酰胺,變性劑梯度為40%～60%(100%變性劑為7mol·L-1尿素和40%的去離子甲酰胺混合物)。每孔上樣30μLPCR產物與加樣緩沖液的混合溶液,在1×TAE電泳緩沖液中,條件為60℃、50V,電泳12h。電泳后對凝聚進行染色,采用銀染方法,圖像用數碼相機照相。

　　1.5數據分析

　　使用SPSS25.0軟件對試驗數據進行處理及單因素方差分析和Pearson相關分析;利用QuantityOne軟件對DGGE圖譜進行數字化處理;利用NCBI的BLAST進行序列同源性比較;利用MVSP3.1軟件分析土壤微生物群落多樣性Shannon-Wiener指數;使用Canoco4.5.1軟件進行冗余分析(RDA)。

　　2、結果與分析

　　2.1不同氮肥對土壤理化性質和植物生長的影響

　　由表3可知,不同氮肥處理對土壤理化性質和植物生長產生不同影響。與對照CK相比,4種氮肥處理后的土壤pH無明顯變化,其中N4處理的pH均下降,而N2處理的pH均上升。與15d相比,30d取樣的所有處理土壤pH均高于15d取樣的對應處理的土壤;土壤電導率均為N4處理最高,N2處理最低;土壤NH+4-N含量均為N3最低,但15d取樣時為N4最高,30d取樣時為N2最高;土壤NO-3-N含量變化均為N2處理最高,N4處理最低。

　　4種氮肥處理后的植株株高均高于對照CK,且均為N1最高,30d取樣時,除N3處理外,其它處理的植株株高均高于15d取樣的對應處理植株;氮肥處理后的植株干質量變化趨勢一致,大小關系為N1>N2>N3>N4>CK,且30d取樣的所有植株干質量均大于15d取樣的對應處理植株。

　　2.2不同氮肥對根際土壤細菌豐度的影響

　　由圖1可知,熒光定量結果顯示不同氮肥處理后的根際土壤細菌數量為3.95×107～6.13×109拷貝數·g-1(干土)。在2個取樣時期,除30d取樣的N4處理低于CK,其它氮肥處理后的根際土壤細菌拷貝數均高于對照CK,4種氮肥處理后的細菌拷貝數大小關系均為N1>N2>N3>N4,不同處理的細菌拷貝數整體趨勢一致,均為先上升后下降。與15d比,30d取樣的所有氮肥處理的細菌拷貝數均高于15d取樣的對應處理。

　　表3土壤理化性質和植物生長的變化

　　圖1細菌基因豐度特征

　　2.3不同氮肥對根際土壤細菌群落結構的影響

　　2.3.1DGGE圖譜多樣性指數

　　用MVSP3.1軟件對DGGE圖譜(圖2)的數字化處理結果進行土壤細菌多樣性指數分析,由表4可知,氮肥處理后的土壤細菌多樣性指數均高于對照CK,樣品處理15d后,N2處理多樣性指數最高,N3處理最低;樣品處理30d后,N1處理多樣性指數最高,N4處理最低。

　　圖2DGGE圖譜

　　2.3.2序列分析

　　對DGGE圖譜中主要差異條帶進行測序,結果用BLAST在GeneBank數據庫中進行同源性比較,由表5可知,所測的序列屬于細菌γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為最多,占總數40%,其次環境樣品占30%,另外還存在擬桿菌綱(Bacteroidetes)和藍藻綱(Cyanobacteria)。

　　表4細菌多樣性指數

　　2.3.3聚類分析

　　對不同氮肥處理后的根際土壤細菌DGGE圖譜進行數字化處理并進行聚類分析,由圖3可知,不同氮肥處理整體聚為三大類群。2組對照聚為一大類且相似度達66.67%,說明未進行氮肥處理的土壤,其細菌群落結構比較穩定,無明顯變化。30d取樣的4個氮肥處理聚為一類且相似度達74.97%,說明氮肥處理時間越長,與第一時期處理相比,細菌群落結構有所差異。

　　表5DGGE條帶的序列比對分析

　　圖3細菌聚類分析

　　2.3.4冗余分析

　　以不同氮肥處理后的土壤細菌DGGE條帶作為響應變量,用土壤的NH+4-N含量、NO-3-N含量、pH、含水量及電導率作為解釋變量進行冗余分析(RDA)。由圖4可知,含水量、pH和電導率對細菌群落結構的影響較大,而NH+4和NO-3含量對細菌群落結構的影響較小。

　　2.4不同氮肥處理后土壤理化性質、細菌群落結構與植物生長情況的相關性分析

　　對不同氮肥處理后土壤理化性質、土壤細菌拷貝數、多樣性指數與植物生長情況進行相關性分析。由表6可知,土壤細菌拷貝數與植物株高和干質量均呈極顯著正相關(r=0.566,P<0.01;r=0.653,P<0.01),土壤細菌多樣性指數與植物株高和干質量均呈極顯著正相關(r=0.502,P<0.01;r=0.668,P<0.01)。pH與細菌拷貝數呈顯著正相關(r=0.390,P<0.05),且與細菌多樣性指數呈極顯著正相關(r=0.527,P<0.01)。

　　3、討論與結論

　　土壤是植物的生長介質和養分的供應者,其理化性狀在一定程度上反映了土壤肥力水平。與未施肥相比,施用銨態氮使根際土壤pH下降,而施用硝態氮使根際土壤pH上升,與喬云發等[18]在水培條件下,研究不同形態氮素對大豆根系形態性狀影響得出的結果相似。土壤電導率是衡量土壤鹽分的指標,土壤鹽分是限制植物生長的重要營養因子之一。結果顯示,NH4Cl處理的土壤電導率高于NH4NO3處理且二者均高于對照CK,與油麥菜(LactucasativaL.)土壤上得出的結果相似[19]。施肥30d后的土壤電導率大于15d對應氮肥處理的土壤,與唐穎等[20]在藍莓(VacciniumSpp)土壤上得出施肥后14d電導率最高的結論不同,其原因可能與植物材料及栽培土壤不同有關。

　　圖4土壤細菌與環境因子的冗余分析

　　表6相關性分析

　　試驗結果顯示,施用氮肥后的西南蠟梅幼苗干質量和株高均高于未施肥的對照CK,4種氮肥中混合氮NH4NO3對植物干質量和株高的促進效果最好,而單一態氮肥中硝態氮優于銨態氮,這與許楠等[9]的桑樹幼苗試驗結果相似。有研究表明,與單一施用NO-3-N或NH+4-N相比,適當比例的NO-3-N和NH+4-N混合施用有利于維持細胞的電性平衡和pH平衡,對植物的生長發育更為有利[21,22],單獨施用NO-3-N容易引起植物根際pH升高,可能會限制植物對其它礦質養分的吸收和利用[23],而單獨施用NH+4-N時,可能會影響植物的葉片和根系的生長進而改變植物的正常生長發育[24,25]。

　　土壤總細菌數量是反映土壤總微生物活性的一個重要指標,該試驗中根際土壤總細菌16SrDNA基因在107～109拷貝數·g-1(干土),與WANG等[26]研究的瑪卡種植紅壤的土壤細菌總量數量級一致。施用氮肥后的西南蠟梅幼苗根際細菌數量均高于未施肥的對照,且相比單一態氮,混合氮NH4NO3處理后的土壤根際細菌數量最多,這與張雪等[8]的研究結果相似。結果顯示,土壤細菌拷貝數與植物株高和干質量均呈極顯著正相關(P<0.01),因此,施肥后根際細菌數量產生差異的原因可能與西南蠟梅幼苗吸收不同氮肥后導致根系生長發育程度不同有關。

　　DGGE圖譜分析顯示,施用氮肥后的土壤細菌多樣性指數均高于未施肥的對照CK,但均未明顯改變細菌多樣性,與魏天嬌等[27]研究的結果相似,其研究結果發現施用氮肥可促進香蕉土壤中氨氧化細菌與古菌的多樣性。相關研究證明,在多種生態系統中pH通常與細菌群落結構有很好的相關性[28,29],這與該試驗相關性分析得出的結果一致,即pH與細菌拷貝數和多樣性指數分別呈顯著正相關(P<0.05)和極顯著正相關(P<0.01)。同時,該試驗結果顯示土壤細菌多樣性指數與植物生長也呈極顯著正相關(P<0.01),因此,細菌多樣性的變化可能與氮肥施用后導致土壤pH改變及植物生長狀況發生變化有關。對優勢DGGE條帶進行測序后發現,變形菌占總數40%,為主要類群,與袁紅朝等[30]和SHEN等[31]對水稻土和小麥土研究所得出的結果一致。

　　綜合分析,結合不同氮肥對西南蠟梅幼苗植株干質量、株高、根際細菌數量及多樣性的影響,在所有氮肥處理中,認為NH4NO3最有利于西南蠟梅幼苗植株生長發育和根際土壤細菌的生長繁殖,建議在對西南蠟梅栽植培育時,將銨態氮和硝態氮混合施用,但要確定銨態氮和硝態氮以何種配比施用對西南蠟梅生長發育和土壤微生物群落最有利,還有待于進一步研究。

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