目前對(duì)采用人工接種發(fā)酵生產(chǎn)桑葉茶及其對(duì)其中DNJ、黃酮、多糖、多酚等主要功能成分含量影響的研究鮮有報(bào)道。本文分別以4種菌單獨(dú)或組合發(fā)酵桑葉制得的桑葉茶，分析其中DNJ、黃酮、多糖、多酚4種功能成分含量變化，為桑葉的深度開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

1）實(shí)驗(yàn)菌種：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；綠色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肅省微生物菌種保藏中心。以上四種菌種的安全等級(jí)均高，其生物危害程度為四類，在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病。

2）實(shí)驗(yàn)樣本：自然發(fā)酵桑葉茶、人工發(fā)酵桑葉茶由本實(shí)驗(yàn)室自制。

2.試劑與儀器

1）主要試劑：DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈為色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；其他常用試劑均為分析純。

2）主要實(shí)驗(yàn)儀器：Waters1525HPLC，美國(guó)Waters公司；5810型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Spectrumlab22可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法

1）發(fā)酵桑葉茶的制備：采摘從頂芽往下數(shù)4-10片的新鮮桑葉，去柄，切為4cm×4cm的小葉片，混勻后稱取100g葉片用微波殺青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然發(fā)酵只加10mL無(wú)菌水)，復(fù)揉，28℃發(fā)酵5h，微波干燥，制得桑葉茶。（注：加菌量共為107cfu，菌種復(fù)配比例為1:1或1:1:1。）2）DNJ的測(cè)定測(cè)試樣品的制備：取桑葉茶粉末0.5g，加入一定量超純水，80℃水浴浸提2h(每20min搖勻一次)，抽濾后，濾渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超純水定容至50mL，即得樣品提取液。DNJ的衍生化及測(cè)定方法按照參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。色譜條件：色譜柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。3）黃酮測(cè)定：取桑葉茶粉末0.5g于50mL離心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超聲提取15min，7000r/min離心5min，抽濾，得到濾液。如此共提取3次，濾液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL濾液，用AlCl3比色法[20]測(cè)定4）多糖測(cè)定：取桑葉茶粉末0.250g于蘭蓋瓶中，加入20mL沸蒸餾水，在100%功率下55℃超聲提取20min，將提取液過(guò)濾后定容至25mL。取1.0mL濾液用苯酚-硫酸法[21]測(cè)定多糖含量。5）多酚測(cè)定：按照GB/T8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法[22]進(jìn)行測(cè)定。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和Spss16進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

結(jié)果和討論

1.各活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

按照3.2）的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)不同濃度DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，得到DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=15776x-70392，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。式中x為DNJ濃度，μg/mL；y為峰面積。按照1.3.3實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=11.622x-0.0031，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。式中，x為蘆丁濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.4的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=10.909x-0.0021，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。式中，x為葡糖糖的濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.5的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0034，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。式中，x為沒食子酸的濃度，μg/mL；y為吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，線性關(guān)系良好，可用于樣品中相關(guān)活性成分的測(cè)定。

2.DNJ標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖

將DNJ經(jīng)衍生化后上高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，得到如圖1、圖2、圖3所示色譜圖：由色譜圖2可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時(shí)間為2.731min，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719min和4.243min，表明這兩種物質(zhì)均不干擾DNJ的測(cè)定。

3.單一菌種發(fā)酵桑葉茶中DNJ等活性成分含量變化

分別以黑曲霉、日本根霉、綠色木霉和青霉的單一接種于桑葉中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)桑葉茶，與自然發(fā)酵生產(chǎn)的桑葉茶比較其DNJ等活性成分含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1：從表1可知，用綠色木霉發(fā)酵所得桑葉茶中DNJ含量為111.28mg/100g.干重，與自然發(fā)酵得到的桑葉茶比較，下降了6.43%，且有顯著性差異（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、?霉發(fā)酵后得到的桑葉茶中DNJ含量均上升，特別是日本根酶發(fā)酵后DNJ含量為131.56mg/100g.干重，與自然發(fā)酵的桑葉茶比較增加10.63%，具有極顯著差異（P＜0.01）。與自然發(fā)酵比較，4種單一菌種發(fā)酵桑葉茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、綠色木霉發(fā)酵的桑葉茶中多糖含量與自然發(fā)酵的比較分別下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有極顯著性差異（P＜0.01）；而日本根霉發(fā)酵桑葉茶中多糖僅下降了2.67%，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與自然發(fā)酵比較，用日本根霉發(fā)酵桑葉茶中黃酮增加了5.78%，有極顯著性差異（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、綠色木霉3種菌發(fā)酵桑葉茶中黃酮含量分別降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、綠色木霉發(fā)酵的桑葉茶中黃酮下降有極顯著差異（P＜0.01）；而?霉發(fā)酵后黃酮含量下降無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與自然發(fā)酵比較，用日本根霉、黑曲霉、青霉、綠色木霉發(fā)酵桑葉茶中的多酚含量分別降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉發(fā)酵桑葉茶中多酚含量下降相對(duì)較少，但也有顯著性差異（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、綠色木霉發(fā)酵的桑葉茶中多酚含量下降有極顯著性差異（P＜0.01）。綜合單一菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，與自然發(fā)酵比較，采用日本根霉發(fā)酵后所得桑葉茶中DNJ、黃酮含量有極顯著增加；而多糖、多酚含量雖然有所下降，但比實(shí)驗(yàn)的其他菌種發(fā)酵后桑葉茶中這兩種成分的下降低很多。因此，從對(duì)發(fā)酵桑葉茶功能成分影響來(lái)看，單一菌種發(fā)酵以日本根酶較好。