材料與方法

1.材料

秈米：市售。試劑及藥品：硫酸銅、酒石酸甲鈉、亞鐵氰化鉀、次甲基藍(lán)、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞、葡萄糖、乙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛、異戊醇、異丁醇，均為分析純。純種根霉曲、嗜殺酵母(Sa2)曲：均由低碳模式[7]制得。0.1N氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取4g氫氧化鈉，用蒸餾水定容到1000mL，同時(shí)標(biāo)定。0.02N氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2g氫氧化鈉，用蒸餾水定容到1000mL，同時(shí)標(biāo)定。0.5%酚酞指示劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g酚酞，溶于100mL95%乙醇中。0.1N鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取9.4mL濃鹽酸，用蒸餾水定容到1000mL，同時(shí)標(biāo)定。標(biāo)準(zhǔn)雜醇油溶液：準(zhǔn)確吸取0.099mL異戊醇和0.025mL異丁醇于100mL容量瓶中，加無(wú)雜醇油酒精50mL，再加蒸餾水定容100mL。使用時(shí)，吸取5.0mL標(biāo)準(zhǔn)雜醇油溶液于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到50mL，此溶液即為0.1mg/mL的雜醇油溶液。0.5%對(duì)二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶于100mL濃硫酸中，本試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.試驗(yàn)方法

(1)工藝路線

釀制小曲酒工藝路線：秈米→洗米→浸米→蒸米→攤涼→拌入純種根霉曲→培菌糖化→拌入嗜殺酵母曲→加水發(fā)酵→蒸餾→小曲酒。

(2)純種根霉曲加曲量對(duì)發(fā)酵的影響

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后分別加純種根霉曲0.2g、0.4g、0.6g和0.8g，于30℃恒溫糖化24h后，加水120mL同時(shí)加入適量嗜殺酵母曲,封口發(fā)酵5d，測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、酸度、總酯和雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為純種根霉曲的加曲量。

(3)糖化溫度對(duì)發(fā)酵的影響

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后按上一步確定的純種根霉曲加曲量加入麩曲，于25℃、30℃、35℃和40℃恒溫糖化24h后，加水120mL同時(shí)加入適量嗜殺酵母曲，封口發(fā)酵5d，測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、酸度、總酯和雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為糖化溫度。

(4)糖化時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后按前面試驗(yàn)確定的純種根霉曲加曲量和糖化溫度操作后，分別恒溫糖化12h、24h、36h和48h后，加水120mL同時(shí)加入適量嗜殺酵母曲，封口發(fā)酵5d，測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、酸度、總酯、雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為糖化時(shí)間。

(5)加水量對(duì)發(fā)酵的影響

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后按前面試驗(yàn)確定的純種根霉曲加曲量、糖化溫度和糖化時(shí)間操作后，分別加水100mL、110mL、120mL和130mL同時(shí)加入適量嗜殺酵母曲，封口發(fā)酵5d，測(cè)定醪液酸度、蒸出酒液的酒精度、酸度、總酯和雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為最佳加水量。

(6)嗜殺酵母曲加曲量試驗(yàn)

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后按前面試驗(yàn)確定的純種根霉曲加曲量、糖化溫度、糖化時(shí)間和加水量操作后，加入嗜殺酵母曲0.4g、0.6g、0.8g和1.0g，封口發(fā)酵5d，測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、酸度、總酯和雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為嗜殺酵母曲加曲量。

(7)發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，冷卻后按前面試驗(yàn)確定的純種根霉曲加曲量、糖化溫度、糖化時(shí)間、加水量和嗜殺酵母曲加曲量操作后，封口發(fā)酵3d、4d、5d和6d，測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、酸度、總酯和雜醇油，綜合理化指標(biāo)較好的確定為發(fā)酵時(shí)間。

(8)小曲酒釀造工藝條件正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為確定嗜殺酵母曲釀造秈米小曲酒的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)整各因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。本試驗(yàn)以出酒率為指標(biāo)做了糖化溫度、發(fā)酵時(shí)間和加曲量（含酵母）三因素三水平的正交試驗(yàn)。其中，C（加曲量）中,0.4%為純種根霉曲加曲量,0.6%、0.8%、1%為嗜殺酵母曲加曲量。

(9)嗜殺酵母曲與市售小曲發(fā)酵結(jié)果比較

取100g秈米洗凈，浸泡4h，放入1000mL三角瓶中，加水100mL，105℃蒸10min，攤晾后按前面試驗(yàn)確定的純種根霉曲加曲量、糖化溫度、糖化時(shí)間、加水量、嗜殺酵母曲加曲量和封口發(fā)酵時(shí)間操作，同時(shí)做市售小曲的對(duì)照試驗(yàn)。測(cè)定醪液酸度、蒸餾出酒液的酒精度、白酒酸度、總酯和雜醇油。

3.分析方法

(1)酒精度的測(cè)定

蒸餾后用酒精計(jì)測(cè)定。1.3.2.2醪液酸度的測(cè)定按酸堿中和法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取2mL濾液于150mL三角瓶中，加蒸餾水20mL和0.5%的酚酞指示劑2滴，用0.1N氫氧化鈉溶液滴定至微紅色，10s不退色。計(jì)算公式：酸度=C×V/2×10式中：酸度—10mL發(fā)酵醪液消耗氫氧化鈉的毫摩爾數(shù)。C—氫氧化鈉濃度,mol/L；V—滴定消耗氫氧化鈉的體積,mL；2—吸取的醪液體積，mL。

(2)白酒中總酸的測(cè)定

運(yùn)用酸堿中和法。準(zhǔn)確吸取1mL白酒，置入250mL三角瓶中，加100mL水和1%酚酞指示劑2滴，用0.2N氫氧化鈉溶液滴定至微紅色，10s不退色。計(jì)算公式：總酸（g/100mL，以乙酸計(jì)）=（NV）×0.06006×1/1×100式中：總酸—100mL蒸餾白酒中乙酸的濃度，g/100mL。N、V—氫氧化鈉溶液的當(dāng)量濃度與消耗體積,mL；0.06006—乙酸的毫克當(dāng)量,g；1—吸取的酒樣體積,mL；100—換算成100mL酒樣中的酸量。

(3)白酒中總酯的測(cè)定

按皂化法。準(zhǔn)確吸取50mL酒樣，置入500mL三角瓶中，加1%酚酞指示劑2滴，用0.1N氫氧化鈉溶液滴定至微紅色。再準(zhǔn)確加入25mL0.1N氫氧化鈉溶液，按上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化30min，取下冷卻，立即用0.1N鹽酸溶液滴定至紅色剛剛消失。計(jì)算公式：總酯（g/100mL，以乙酸乙酯計(jì)）=（N1×25－N2V2）×0.08812×100/50式中：N1—氫氧化鈉溶液的當(dāng)量濃度（0.1N）；N2、V2—鹽酸溶液的當(dāng)量濃度（0.1N）與消耗體積（mL）；0.08812—乙酸乙酯的毫克當(dāng)量，g；

(4)白酒中雜醇油的測(cè)定（比色法）

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取10mL刻度試管6支，配制不同的標(biāo)準(zhǔn)雜醇油溶液（雜醇油含量為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg）各2mL加入試管，將試管置入冷水浴中冷卻，以較慢的速度，沿傾斜的試管壁準(zhǔn)確加入4mL0.5%對(duì)二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液，搖勻。將試管置入沸水浴中，加熱顯色20min，取出迅速冷卻，用水定容至10mL，搖勻。在波長(zhǎng)485nm下測(cè)吸光度，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)雜醇油濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由曲線求得線性回歸方程為：y=6.4071x+0.0398，R2=0.9885。說(shuō)明該曲線在雜醇油含量介于0~0.1mg范圍內(nèi)有的線性關(guān)系。測(cè)定步驟:吸取1mL酒樣，加水定容至10mL。吸取1mL酒樣稀釋液，加入10mL刻度試管中，加水至2mL，之后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備。以空白管為對(duì)照，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，取其平均值。從已繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣管光密度所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)雜醇油含量（mg）。計(jì)算公式：雜醇油（g/100mL）=A×10×100/（V1×V2×1000）式中：A—測(cè)定樣品稀釋液中雜醇油含量,mg；V1—所取酒樣體積,mL；V2—所取稀釋酒樣體積,mL；10—酒樣稀釋倍數(shù)。