作者：葉文 楊柳青 張如勝 歐新華 宋克云 單位：長沙市疾病預防控制中心微生物檢驗科

沙門菌屬是引起細菌性食物中毒的重要病原體之一,目前全世界已分離出2523個血清型,我國已發現216個[1]。快速敏感的檢測方法對沙門菌食品衛生檢測來說至關重要。傳統檢測沙門菌的分離培養方法煩瑣費時;免疫學方法敏感度有待提高;各種聚合酶鏈反應(PCR)方法具有敏感、特異的優點[2-5],但由于需要特殊的儀器設備而限制了其在基層單位的應用。環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalam-plification,LAMP)技術[6,7]是一種新型等溫核酸擴增方法,針對靶基因設計4~6條引物,利用一種具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在恒溫條件(60~65℃)保溫約60min,即可完成核酸擴增反應,產物為針對靶基因擴增產生的各種大小的莖環狀DNA混合物,副產物為肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀。目前已有多篇針對沙門菌的LAMP檢測研究報道[8,9],這些研究多側重于檢測方法的建立,大多和核酸檢測方法,如PCR方法進行對照研究,而且用于實際樣品檢測研究也較少。為此,本文利用文獻報道的沙門菌屬LAMP檢測方法[8]對135份食品標本進行LAMP檢測,同時和分離培養法檢測結果進行比較來評價沙門菌屬LAMP檢測方法在食品衛生檢測中的實際應用價值,現將研究結果報告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);DK-8D電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司);全自動微生物鑒定系統(美國BD公司);BstDNA聚合酶(北京紐英倫生物技術有限公司);Betaine、Mg-SO4(美國Sigma-Aldrich公司);SYBRGreenInu-cleicacidgelstain、SYBRSafeDNAGelStain(美國invitrogen);dNTP(北京天根公司);通用型核酸提取試劑盒(廣州華瑞安生物);緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、三糖鐵瓊脂(TSI)、賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂平板(廣州環凱微生物科技有限公司)。

1.1.2標本來源2010年7月~10月收集的食品標本135份(冷凍生肉:16份;生鮮肉:20份;熟肉制品:21份;即食非發酵豆制品:17份;速凍米面制品:16份;冰激凌:10份;生水產品:18份;沙拉:6份;鮮榨果汁:7份;生食類蔬菜:4份),見表1。陽性控制菌株為腸炎沙門菌。

1.2方法

1.2.1食品樣品的前增菌參照《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[10]標準將收集的食品標本分別取25g,加入到225mlBPW的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1~2min后37℃培養8~18h,如為冷凍產品,應在45℃以下不超過15min解凍。

1.2.2LAMP檢測食品中的沙門菌分別取1ml食品標本前增菌液10000r/min離心2min,棄其上清液后,利用核酸通用提取試劑盒進行核酸提取,再取1μl上清液做待檢模板DNA。利用文獻[2,10]報道的LAMP檢測方法及引物對135份食品標本增菌液DNA進行檢測,反應體系(25μl):FIP、BIP(40μM)各1.0μl,F3、B3(10μM)各0.5μl,10×BstDNA聚合酶Buffer2.5μl,dNTPMixture(10mM)3.5μl,Betaine(5M)5.0μl,Mg-SO4(250mM)0.6μl,BstDNA聚合酶(8U/μl)1.0μl,DNA模板2μl,加ddH2O至25μl。輕彈混勻后于水箱內65℃孵育60min,80℃2min滅活酶結束LAMP反應。LAMP反應結束后可直接進行肉眼檢測:檢測管出現明顯渾濁為陽性,未見渾濁為陰性;也可將LAMP產物加熒光染料(1000×SYBRGreenI)2μl,1~5min觀察結果,反應液變綠為陽性,保持無色或棕色為陰性。電泳鑒定:1μl擴增產物與0.2μl上樣緩沖液混勻后點樣于含適量SYBRSafeDNAGelStain的2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳約60~100min,電泳圖片顯示為最小片段>100bp的LAMP特征性梯狀條帶,結果為陽性;如無任何條帶則結果為陰性;如見最小片段<100bp的梯狀條帶,則判斷為非特異性擴增,需要重新檢測。

1.2.3食品中沙門菌的分離培養鑒定參照《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[10]標準分別將135份培養過的食品標本前增菌液輕輕搖動后取1ml,轉種于10mlTTB增菌液內,于42℃培養18~24h。另取1ml,轉種于10mlSC增菌液內,于37℃培養18~24h;分別取食品標本的增菌液1環,劃線接種于一個BS平板和一個XLD平板,于37℃培養18~24h;挑取3個可疑菌落,接種TSI、賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂平板,于37℃培養18~24h。如果生化反應初步符合沙門菌特征,從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當菌懸液,使用全自動微生物鑒定系統進行分析,必要時做血清學分型。若BS平板和XLD平板上都無可疑菌落,將BS平板于37℃繼續培養18~24h,仍無可疑菌落可確定為沙門菌陰性。

1.3統計分析

利用SPSS13.0軟件對數據進行統計分析。分析方法為配對設計的χ2檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1沙門菌LAMP檢測和分離培養結果135份食品標本增菌液經LAMP檢測出沙門菌屬陽性標本14份,陽性率為10.4%;經分離培養法分離出沙門菌陽性菌株6份,陽性率為4.4%,見表1。電泳檢測結果,凝膠瓊脂糖電泳出現最小片段>100bp的LAMP特征性梯狀條帶為陽性,見圖1。

2.2兩種方法檢測結果LAMP法和分離培養法兩種檢測方法皆為陽性有5份;兩種檢測方法皆為陰性有120份;LAMP法陽性而分離培養法為陰性有9份;分離培養法陽性而LAMP法為陰性有1份。LAMP法檢測陽性率高于分離培養法(P=0.021),見表2。

3討論

本研究中利用LAMP方法對實際食品標本的前增菌液進行核酸檢測,并和平行檢測的分離培養法進行了檢出率的比較。結果顯示,LAMP法檢出率更高,達10.4%,而分離培養法只有4.4%,LAMP法檢測陽性率更高。研究中參照的國家標準《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[10]需要經過前增菌、增菌、分離、篩選可疑菌落、生化和血清學鑒定這幾個步驟,得到陰性結果往往需要4d左右,檢出沙門菌至少需要7d。

另外,分離培養法的生化鑒定存在繁瑣或需要昂貴的全自動微生物鑒定系統的不足之處血清學分型也存在效價低、試劑昂貴和易失效等缺點不利于基層特別是區縣疾病預防控制中心的使用。分離培養法需要經過兩次增菌后再進行分離培養,而LAMP法檢測只需要采用前增菌液進行核酸提取后即可開始LAMP擴增試驗,在60min即可以完成LAMP擴增過程,本研究利用LAMP方法可以在24h(包括食品標本的前增菌過程)內檢出食品標本中的沙門菌屬,相比分離培養法更快速。另外,LAMP法還可以利用肉眼判斷結果,比較直觀方便,這對生鮮食品的快速檢測具有重要意義。