密閉系統下鮮切獼猴桃呼吸代謝特性研究

　　摘要：目的 探究鮮切獼猴桃的呼吸代謝特性，為氣調包裝的設計及鮮切獼猴桃貨架期的預測提供參考。方法 以“海沃德”獼猴桃為試材，采用密閉系統法，對鮮切獼猴桃貯藏過程中密閉系統中的氣體體積、乙醇含量及相關品質指標進行測定。結果 隨著貯藏時間的增加，密封系統內逐漸進入低氧狀態;對鮮切獼猴桃的呼吸速率進行擬合，其擬合度較高;基于 Michaelis-Menten 方程建立了鮮切獼猴桃的酶動力學呼吸模型，該方程的決定系數(R 2)在 0.9 以上，最大呼吸速率為 6.36 mL O2/(kg • h)和 6.53 mL CO2/(kg • h);果實的乙醇含量在 144 h 后驟然上升，這可能是鮮切水果密閉包裝條件下的發酵閾值點。結論 鮮切獼猴桃的呼吸代謝過程符合一級動力學特性，米氏模型的擬合度較高。本研究中鮮切獼猴桃于 144h 后進入無氧呼吸狀態，可為 MAP 的設計及鮮切獼猴桃貨架期的預測提供參考。

　　本文源自王云香; 李文生; 孟燕華; 周家華; 常虹; 王寶剛， 包裝工程 發表時間：2021-06-23

　　關鍵詞：獼猴桃;呼吸速率;發酵閾值;品質;密閉系統

　　鮮切水果又被稱為輕加工水果，是在保持水果產品生鮮狀態、保留產品原有的風味和營養成分的基礎上，最少加工的水果產品。鮮切水果具有快捷、方便、衛生等特點，國內的需求量也是越來越大，存在著具大的商業潛力[1-3]。獼猴桃是公認的“Vc 之王”，果實中的 Vc 含量很高，且其果實鮮香多汁，酸甜適口，受到消費者的廣泛喜愛。鮮切獼猴桃也成為鮮切水果中不可或缺的產品。但由于獼猴桃鮮切加工后呼吸作用強烈，易失水、軟化或腐爛，導致產品的貨架期短，保鮮難度大[4]。

　　國內外針對鮮切水果的保鮮技術已開展了較多研究，例如氣調保鮮[5]、臭氧處理[6]、涂膜保鮮[7,8]、冷等離子[9]處理等。其中，氣調包裝(modified atmosphere packaging,簡稱 MAP)技術在果蔬保鮮方面取得較好效果。在氣調包裝系統中，包裝薄膜的透氣性與果蔬的呼吸作用會形成平衡，使包裝的內環境中氧氣體積分數低而二氧化碳體積分數高，從而抑制了果蔬的呼吸和生理代謝作用，從而延長果蔬貯藏時間的一種包裝技術[10]。氣調包裝的設計與包裝產品自身的呼吸速率、貯藏環境的溫度和相對濕度等因素有關。對于恒定溫濕度條件下，果實呼吸速率模型的建立對于氣調包裝的設計非常重要[11-12]。因此，本研究擬通過研究鮮切獼猴桃在密閉系統中的呼吸速率變化規律，建立呼吸代謝的模型，預測其發酵閾值，為鮮切獼猴桃的貨架期預測提供理論依據。

　　1 材料方法

　　1.1 材料與設備

　　供試原料為“海沃德”獼猴桃，產地陜西，購自北京新發地農產品批發市場。挑選成熟度一致(硬度約為 7.8 kg/cm2)，果形基本一致，果面完好，無機械傷、無病害、潔凈的果實經預冷至 4℃后備用。

　　乙醇標品，色譜級，純度為 99.9%，購買自美國 Sigma-Aldrich 公司。 O2/CO2氣體分析儀(CheckMate II 型)，FT-02 型硬度計(探頭直徑 6 mm)，PAL-1 型折光儀，794 型電位滴定儀，Waters 2695 液相色譜儀。

　　1.2 樣品制備

　　將獼猴桃果實浸泡于 200 mg/L 次氯酸鈉溶液中消毒 2 min，取出后清水漂洗 3 次，去皮、切片(厚度 10 mm)，然后裝入密閉系統中，密封，貯藏于冷庫中(4±0.5℃)。每盒樣品約 0.4 kg，初始時密封系統中氣體條件為大氣狀態(21℅ O2、0.03℅ CO2)。試驗重復三次。

　　1.3 密閉系統的設計

　　本研究所使用的密閉系統如圖 1 所示。根據實驗樣品體積選擇適宜大小、密封性良好的樂扣保鮮盒(聚丙烯，PP 材質)，然后在盒蓋上打孔，安裝硅膠管用于氣體取樣與循環。試驗前進行了密閉性測試，密封盒密閉性良好。用排水法測得此密閉系統的體積為 1.2 L，產品占用體積約 0.8 L，自由體積約 0.4 L。

　　1.4 測定項目

　　1.4.1 品質指標

　　果實硬度和可溶性固形物含量分別采用硬度計 (FT-02, Facchini, Italy, 探頭直徑 6 mm) 和糖度計 (PAL-1, Atago, Japan)進行測定[13];果實可滴定酸含量的測定用電位滴定儀進行 [14];Vc 含量的測定采用高效液相色譜法 [15]。在原料品質指標測定時，硬度和可溶性固形物取 10 個果進行測定，平行 10 次;可滴定酸和 Vc 含量測定將 10 個果混合，重復 3 次。在鮮切獼猴桃貯藏過程中，可溶性固形物取 10 片果進行測定，平行 10 次;可滴定酸和 Vc 含量測定將 10 片果混合，重復 3 次。單果重采用天平(TE601-L 電子天平，德國賽多利斯公司)進行測定;果實橫徑、縱徑及厚度采用游標卡尺(Santo，上海賽拓五金工具有限公司)。

　　1.4.2 氣體體積變化及呼吸速率

　　利用密閉系統法對包裝內氣體體積及果實呼吸速率的變化進行測定。具體操作為將密封盒放置于冷庫恒定的溫度條件下(4℃)密閉一定時間后，抽取密封盒中頂空氣體，測量氧氣和二氧化碳的濃度，并通過下列方程計算果實的呼吸速率[16,17]：?? ? ? ? ?? ? f i i f O M t t O t O t V R ? ?? ?? 100 2 2 2 (1) ?? ? ? ? ?? ? f i f i CO M t t CO t CO t V R ? ?? ?? 100 2 2 2 (2) 式中：RO2 和 RCO2 分別代表氧氣消耗和二氧化碳生成的速率，mL/(kg·h);[O2]ti 和 [O2]tf 分別代表測量的起始和終止時氧氣的體積分數，%;[CO2]ti 和[CO2]tf 分別代表測量的起始和終止時二氧化碳的體積分數，%;ti和 tf分別代表測量的起始和終止時間，h; V 是密封盒的自由體積，mL;M 是樣品的質量，kg。

　　1.4.3 呼吸商

　　呼吸商(RQ)也稱作呼吸系數，呼吸商越大，果實吸入氧氣的量就越小，氧化時釋放出的能量就越少[8]。若果實的呼吸商值發生了變化，則表明呼吸代謝消耗的底物比例發生了變化。通常認為，當 RQ 的值大于 1.3 時果蔬則產生了厭氧呼吸。呼吸商的計算公式如下所示[12]： 2 2 / CO O RQ ? R R (3)

　　1.4.4 閾值

　　引發鮮果厭氧呼吸的 CO2 和 O2 氣體濃度臨界值通常被稱為發酵閾值[7]。在密閉系統中，CO2 和 O2 的氣體濃度存在一定的相關性，可以進行擬合得到線性方程。根據 RQ 值(大于 1.3)及得到的線性方程，結合實際測量數據代入方程后確認閾值[18]。擬合線性方程 y=ax+b (4) 式中：a、b 為方程常數;本研究中 y 指 CO2體積分數，x 指 O2體積分數。

　　1.4.5 酶動力學模型

　　酶動力學模型是一種常見的呼吸速率模型，研究證明作為的無競爭型抑制形式與大部分果蔬的呼吸機制類似，并以此公式來建立的模型得到了廣泛的應用。其方程如下[16]：? ?? ? ? ?? ? 2 2 2 K 1 CO / K O V O R m i m ? ?? (5) 式中： R 代表著 果 蔬 的 呼吸速率， mL/(kg·h) ; Vm 是果蔬的 最 大 呼 吸 速 率 ， mL/(kg·h);[O2]和[CO2]分別是產品包裝內部某一時刻 O2和 CO2的體積分數，%; Km是米氏常數，%;Ki是 CO2的非競爭抑制系數，%。式(5)化作線性形式如下：? ?? ? 2 2 1 1 1 1 CO V O K V K R V m i m m m ? ? ? (6) 根據試驗測定得到的 O2和 CO2體積分數以及計算得到對應的 O2消耗和 CO2生成的速率，利用 spssau 線上平臺分析，得到果實的呼吸方程參數。

　　1.4.6 乙醇含量測定

　　鮮切產品的乙醇含量測定參考侯玉茹等[19]所用方法。稱取樣品 20.0 g，在 10 mL 的超純水中進行研磨，隨即轉入 100 mL 的容量瓶中進行定容，然后提取 10 min，之后先用濾紙過濾后再過 0.45 μm 濾膜，濾液當即使用液相色譜進樣測定。

　　液相色譜使用的色譜柱為 DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱 。色譜柱的溫度使用的是程序升溫的方法，柱溫首先在 40 ℃的條件下保持 11 min，之后以 20 ℃/min 的速率升至 220 ℃，保持 13 min。進樣口的溫度設置為 230 ℃，使用的檢測器為 FID，溫度設置為 300 ℃。采用氮氣作為載氣，柱流量為 2 mL/min，進樣量是 1 μL，分流比是 20:1。

　　2 結果與分析

　　2.1 基礎指標

　　在本次試驗中，獼猴桃基礎指標如表 1 所示。其單果重量大于 132 g，果實縱徑大于 50 mm，可溶性固形物含量大于 11%，可滴定酸含量小于 0.8%。

　　2.2 貯藏期間氣體含量變化

　　由圖 2 可以看出，隨著貯藏時間的增加，鮮切獼猴桃密封系統中 O2所占的體積分數呈降低趨勢，CO2 的體積分數則表現為升高趨勢，O2 體積分數變化曲線與 CO2 體積分數變化曲線會在某點相交，這是典型的密閉系統中 O2和 CO2體積分數的變化規律。之前有研究表明，溫度越高，密封盒內產品的呼吸代謝強度越高，密切系統中 O2和 CO2的體積分數變化速度越快，兩條變化曲線則越早相交[12]。在本研究中，隨著貯藏時間的增加，O2和 CO2的體積分數變化曲線在 96 h 相交，此時 O2和 CO2的體積分數分別為 8.80%和 9.43%，與初始的氣體成分相比，O2 含量降低了 12.2%，CO2 增加了 9.4%。在貯藏結束(156 h)時，O2 和 CO2的體積分數分別為 7.20%和 10.79%。

　　2.3 貯藏期間呼吸速率變化

　　由圖 3 可見，鮮切獼猴桃果實的呼吸速率在貯藏初期是最高的。貯藏過程當中，多半時間段 Ro2高于 Rco2。在 72 h 首次出現呼吸速率的回升高峰，在 108 h 時和 150 h 出現第二次和第三次，在這三個時間點 Rco2明顯升高。并且，在 72 h 和 150 h RCO2高于 Ro2 。在貯藏過程中，在 120 h 時出現了呼吸速率的最低值，果實的呼吸強度接近于 0。對于貯藏期間呼吸速率降低過程中出現回升，呼吸速率折線圖起伏，與高萌[20]的結果相一致。對此現象仍未有較為合理的解釋，有待進一步深入的研究。但是，從整體看，隨著貯藏時間的不斷增加，密封環境中果實的呼吸強度整體呈不斷下降趨勢，且多數時間段 Ro2 高于 Rco2。出現該現象主要是因為密閉系統法的測定在封閉的容器中進行，O2 濃度不斷下降，而 CO2 濃度不斷上升，果實呼吸強度會受到低氧環境的影響而減弱，也可以說果實的呼吸得到抑制。這種情況與前人研究中果實在密閉環境中的前高后低的呼吸速率變化規律是一致的[21- 23]。

　　2.4 呼吸商和閾值

　　鮮切獼猴桃呼吸商的變化如圖 5 所示，其值在 0.7~1.3 之間波動。根據公式(3)計算在貯藏時間是 150 h 的時候 RQ 大于 1.3，此時的氣體含量為 O2 7.6%和 CO2 10.66%。根據 1.4.4 中發酵閾值的計算方法，建立了密封盒內 O2 濃度和 CO2 濃度的線性關系，其相關系數 R 2 為 0.995，同時擬合得到了兩者的一次線性方程的如圖 4 所示，結合呼吸商出現時的氣體體積分數，分別將 150 h 與前后兩個時間點的氣體分數代入計算，根據計算結果，得到了閾值為 144 h O2 8.11%和 CO2 9.99%。根據呼吸商與呼吸閾值的結果，表明鮮切獼猴桃對低溫低氧環境有一定耐受性，可以延緩厭氧呼吸的發生，在荔枝[22]、草莓[12]等水果的研究中也得出相似的結果。

　　2.5 酶動力學模型

　　米氏模型參數的計算是采用在線分析軟件 spssau 進行的。模型得到的各參數值如表 2 所示。兩組參數決定系數(R 2)均大于 0.9，表明該模型的擬合度較高。其中 Vm 表示果實的最大呼吸速率，最大 RO2是 6.36 mL /(kg • h)，最大 RCO2是 6.53 mL /(kg • h)。Km和 Ki是方程的常數，將其代入模型的方程中，得到鮮切獼猴桃果實的呼吸模型如下。根據該模型可以預測鮮切獼猴桃的呼吸速率。

　　2.6 貯藏期間乙醇含量的變化

　　果實進入無氧呼吸之后，會產生乙醇等無氧代謝產物，因此，果實中乙醇含量可以作為判斷是否產生無氧呼吸的主要依據[24,25]。我們測定了鮮切獼猴桃貯藏過程中乙醇含量的變化。如圖 6 所示，在貯藏的初始階段，乙醇含量較低，僅有 36.52 mg/kg。且在有氧呼吸階段，乙醇含量處于相對穩定狀態。在達到發酵閾值 144 h，即進入無氧呼吸階段時乙醇含量驟然升高。最高時的乙醇含量為 285.08 mg/kg。

　　2.7 品質指標

　　果實在采收后的貯藏過程中生理代謝仍在進行。在此過程中，果實中的一些營養成分會作為“呼吸基質”而被消耗。如表 3 所示，在貯藏的起始(0 h)獼猴桃果實中的可滴定酸含量最高，隨著貯藏時間的增加其含量呈現出了降低的趨勢;可溶性固形物含量呈現出緩慢升高的趨勢;而 Vc 含量最高時可達到 49.4 mg/100g，達到發酵閾值 144 h 后，Vc 含量開始下降。根據各項指標數據我們計算出，初始狀態與貯藏結束相比，可溶性固形物含量升高了 13%，可滴定酸含量降低了 11%，Vc 含量下降了 18%。

　　3 結語

　　離體的果蔬其細胞內仍進行著旺盛的呼吸代謝，在一定程度上呼吸越旺盛其保鮮期越短。果蔬氣調包裝借助果蔬自認呼吸與包裝材料的透氣性的相互作用形成能抑制果蔬呼吸的氣體環境，從而延長果蔬保鮮期[10]。因此，建立果蔬呼吸速率預測模型是氣調包裝設計的關鍵技術之一[11-12]。酶動力學呼吸模型是一種常見的呼吸速率預測模型，以此公式來建立的模型得到了廣泛的應用[16]。該方法是將測定得到的 O2 和 CO2 體積分數以及計算得到的對應 O2消耗和 CO2生成速率代入模型，求得果實的呼吸方程參數。在本研究中，在密閉系統低溫貯藏條件下，由于貯藏環境中氧氣含量減少、二氧化碳含量升高，鮮切獼猴桃呼吸速率整體呈逐漸降低趨勢，這與前人研究中果實在密閉環境中的呼吸速率變化規律是一致的[21-23]。。將試驗得到的參數代入模型，發現鮮切獼猴桃果實呼吸代謝過程符合一級動力學特性，模型中參數的 R 2 均大于 0.9，表明模型擬合度較高，能較好預測其呼吸速率變化規律。在 4℃密封環境中鮮切獼猴桃的最大呼吸速率為 6.36 mL O2/(kg • h)和 6.53 mL CO2/(kg • h)。果蔬呼吸分為有氧呼吸和無氧呼吸，無氧呼吸會產生大量乙醇等無氧代謝產物而影響果蔬品質[24]。鮮切果蔬氣調包裝希望果蔬有氧呼吸降至最低安全水平但不會引起無氧呼吸。在本研究中，鮮切獼猴桃于 144h 后進入無氧呼吸狀態，可耐受的氣體濃度為 O28.11%和 CO29.99%。本研究結果可為鮮切獼猴桃果實的保鮮及包裝材料參數的選擇提供理論依據。