兩個新臺糖甘蔗品種的GISH分析

　　【摘 要】用 DIG 標記的原始親本印度割手密(父本)DNA 和用 Biotin 標記的原始親本黑車里本(母本)DNA 為探針分別對 2(新臺糖 25 和新臺糖 16)個云南甘蔗主栽品種進行雙色基因組原位雜交(GISH)。由雜交結果可以看出，在 2 個供試甘蔗栽培品種的基因組中，含有栽培原種—— 熱帶種(黑車里本)血緣的染色體有 82-96 條，含有野生種——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血緣的染色體有 10-25 條，而發生交換、重組的染色體有 2-4 條，都表現出明顯的差異。GISH 技術為揭示甘蔗栽培品種基因組的血緣組成差異提供了科學依據。

　　本文源自羅宗蘋， 農家參謀 發表時間：2019-06-14《農家參謀》(月刊)創刊于1983年，是由河南省科學技術協會主辦的服務農家發展的刊物。本刊始終堅持“面向農村、立足農業、服務農民”的辦刊宗旨，不遺余力地傳播先進的科學技術與最新的致富信息，培育出了一批種植、養殖高手和市場經營能手，無數讀者在《農家參謀》的指導下，擺脫了貧困，走上了富裕之路，成為至富帶頭人。

　　【關鍵詞】甘蔗;染色體;基因組原位雜交

　　甘蔗(S.sinense Roxb )不僅是世界和我國最主要的糖料作物，而且在能源和動物飼料開發方面具有廣闊的應用前景。甘蔗優良品種的育成，有賴于種質資源的開發和利用。甘蔗是高度多倍性的植物，現代甘蔗栽培品種是一個遺傳背景復雜的多倍體 , 其基因組的主體成份為熱帶種血緣 , 同時又導入不少近緣種血緣 , 如割手密種、印度種、大莖野生種、中國種和斑茅等面對甘蔗復雜的遺傳特性，人們為了更深的研究甘蔗，在甘蔗研究技術上應用了原位雜交。原位雜交 (in situ hybridization) 技術是 1969 年由 Gual 和 Par 首次提出的。它是一種把核酸分子雜交技術與組織學定位相結合的 DNA 分子標記技術，即利用標記的 DNA 探針 (probe) 與染色體上的 DNA 雜交，以檢測細胞中特定基因在染色體上的位置、活性和表達。因這種雜交是待測 DNA 分子位置不變而進行的雜交，所以稱之為“原位雜交”，具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點。

　　基因組原位雜交 (GISH) 是利用標記物標記基因組總 DNA，以其作探針與染色體制片進行原位雜交檢測目標 DNA 的一種技術。甘蔗的根尖染色體制片較難獲得清晰干凈的染色體，本研究借鑒 GISH 技術在植物上的應用，從制取甘蔗良好的染色體制片入手，改進探針標記條件，確定恰當的探針總 DNA 與封阻總 DNA 的濃度比例，建立甘蔗 GISH 分析技術體系。為甘蔗創新種質材料的保存及在甘蔗育種中的應用提供科學依據，為新臺糖抗逆、廣適、高產、高糖的新品種的培育或對一些不良特性的進行改良。甘蔗育種家對常用的親本材料進行親緣關系分析 , 發現現有親本主要來自常用的原始祖先熱帶種、印度種、割手密和大莖野生種 , 全世界甘蔗栽培種十之八九均含有這幾個親本血緣。目前，云南高原蔗區，在主栽品種中，新臺糖品種(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)的種植面積約占總面積的 45%，查閱以上新臺糖甘蔗主栽品種的血緣關系可以看出：5 個臺灣品種(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)除了含有傳統的熱帶種、印度種、中國種、割手密野生種等原始親本的血緣外，又增加了“大莖野生種”的血緣，是大莖野生種的第 4、5 代;這些原始親本(祖親種)在栽培品種血緣中具有關鍵作用，云南主栽的這些甘蔗品種都有比較完整的系譜記錄，為雜交親本的選配提供了重要依據。

　　1 材料與方法

　　1.1  試驗材料及所使用的儀器設備

　　1.1.1  試驗材料

　　云南農業大學甘蔗所甘蔗資源圃所種植的新臺糖 25 和新臺糖 16 的幼嫩根尖。

　　1.1.2  試驗儀器及設備

　　離心機、低溫冰箱、PCR 儀、干燥箱、水浴鍋、移液槍、ZEISS 熒光顯微鏡等。

　　1.2  試驗方法

　　1)試驗材料的種植;2)玻片的準備;3)探針的獲得與標記;4)雜交預處理;5)雜交;6)雜交后的洗脫;7)雜交信號的檢測。

　　2 結果與分析

　　本實驗以 Biotin 標記的熱帶種黑車里本 DNA 作為母本探針、采用 DIG 標記野生種印度割手密 DNA 作為父本探針，與云南主栽的新臺糖 25和新臺糖 16 甘蔗品種進行單、雙色雜交，染色體底色則用 DAPI 襯染，雜交圖可以看到染色體上都有雜交信號。

　　基因組原位雜交中，經 DIG 標記系統標記后的父本 DNA 探針雜交信號為紅色，經 Biotin 標記系統標記后的母本 DNA 探針雜交信號為綠色。雙色原位雜交中(圖 1，圖 2)，母本探針的雜交信號仍為綠色，而 DIG 標記的父本探針的雜交信號除紅色外還會出現橙紅色，雙親探針的交叉雜交信號則為黃色，由結果發現，母本探針既能與母本染色體出現雜交(呈綠色)又能與父本染色體在特定區域雜交(呈黃色)，同時父本探針也不僅與父本的整條染色體雜交(呈紅色或橙紅色)，還與母本染色體的特定區域發生部分雜交(呈黃色)。

　　圖1中 A：淺紫色為 DAPI 襯染的檢測信號。B：紅色代表 DIG 標記的父本 DNA 探針的雜交信號，C：以印度割手密及熱帶種黑車里本 DNA 標記的探針與新臺糖 25(ROC25)得到染色體進行雙色原位雜交的結果(比例 =10 µm)。A—C 中的白色長箭頭示完整的父本染色體，白色短箭頭示父本染色體斷片，藍色箭頭示父母本間的重組染色體。

　　圖2中 D：淺紫色為 DAPI 襯染的檢測信號。E：紅色代表 DIG 標記的父本 DNA 探針的雜交信號，F：以印度割手密及熱帶種黑車里本 DNA 標記的探針與新臺糖 16(ROC16)得到染色體進行雙色原位雜交的結果(比例 =10 µm)。D—F 中的白色長箭頭示完整的父本染色體，白色短箭頭示父本染色體斷片，藍色箭頭示父母本間的重組染色體。

　　3 討論與結論

　　3.1  討論

　　1)基因組原位雜交(GISH )是對遠緣雜交后代中的染色體進行鑒定的有效工具，用不同標記系統標記的雙親 DNA 探針可將來自不同親本的染色體有效區分開來，即便對親緣關系較近的親本間雜交獲得的后代材料的染色體也能獲得理想的鑒定結果;

　　2)傳統的觀點認為不同染色體間的交換現象，只出現在減數分裂時聯會配對的同源染色體之間，而不會在有絲分裂過程中出現。但也有研究發現染色體的重組現象發生于物種間雜交 F1 代，王先宏等的研究也在 YAU 01/49 后代材料中發現有 2 條染色體可能源于父、母本染色體間的互換，但是還有待進一步加以研究證實。因此有人推測不同染色體間的交換現象可能來自于受精后體細胞的有絲分裂，而與減數分裂過程無關;

　　3)本實驗以 Biotin 標記的熱帶種(黑車里本)DNA 作為母本探針、采用 DIG 標記割手密(印度 1 號、印度 2 號)DNA 作為父本探針，與云南主要栽培的新臺糖 25 和新臺糖 16 甘蔗品種進行單、雙色雜交，染色體底色則用 DAPI 襯染。雜交結果可以發現，幾乎每個品種都有 2-4 條染色體各自的末端部分，都很明顯的出現了另一親本的探針雜交信號，可能是種重復序列表現出來的信號，也可能是母本的 1 條染色體與父本的一條染色體分別在末端出現交換，而形成了染色體的重組。

　　3.2  結論

　　本實驗中材料的染色體組成

　　注：Ss：父本(印度割手密)，So：母本 ( 熱帶種 )，Ss & So：父母本間的重組染色體。

　　通過 GISH 技術在 2 個甘蔗栽品種新臺糖 25 和新臺糖 16 的基因組中的實驗得出：含有栽培原種——熱帶種(黑車里本)血緣的染色體有 82-96 條，含有野生種——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血緣的染色體有 10-25 條，而發生交換、重組的染色體有 2-4 條，都表現出明顯的差異，為揭示甘蔗栽培品種新臺糖 25 和新臺糖 16 基因組的血緣組成差異提供了科學依據。