摘 要:比較了野生桑樹桑黃和楊樹桑黃子實體乙醇提取物抗氧化活性和化學成分的差異,探討其高抗氧化能力的來源。以二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)清除率、超氧陰離子清除率和 β-胡蘿卜素漂白實驗作為抗氧化的指標比較其抗氧化活性差異。結果表明,桑樹桑黃和楊樹桑黃均具有很強的抗氧化活性,楊樹桑黃的抗氧化活性顯著強于桑樹桑黃;楊樹桑黃醇提物的總黃酮和總多酚含量均高于桑樹桑黃醇提物。通過超高效液相色譜串聯三重四級桿飛行時間質譜法(UPLC-Triple-TOF-MS)比較了桑樹桑黃和楊樹桑黃乙醇提取物成分差異,桑樹桑黃中共鑒定出 19 種多酚類物質,楊樹桑黃中除了與桑樹桑黃中相同的 19 種物質,還另外分析出 3 種多酚類物質。
本文源自呂國英; 宋婷婷; 蔡為明; 張作法, 菌物學報 發表時間:2021-05-20《菌物學報》(雙月刊)(英文刊名Mycosystema)的前身為《真菌學報》,創刊于1982年,是由中國科學院主管、中國菌物學會主辦的我國菌物學(真菌、粘菌、卵菌)領域的專門學術期刊。《菌物學報》報道該領域的最新研究進展和具創造性或較高學術水平的論文和簡報。已在國內外學術界享有較高的聲譽,對繁榮和發展我國真菌科學并與國際接軌作出了積極貢獻。
關鍵詞:桑黃,抗氧化,化學成分,超高效液相色譜串聯三重四級桿飛行時間質譜法
亞健康狀態使機體內產生大量過剩的活性氧自由基,造成機體組織細胞中生物大分子發生變形、交聯、斷裂等現象,從而造成氧化損傷,引起各種疾病(Durazzo et al. 2019)。為了達到預防和緩解各類疾病的目的,生物體需要從外界攝入一些有效的抗氧化劑,從而使機體的抗氧化水平得到顯著提升。開發天然高效的抗氧化劑不僅對預防和治療各種自由基引起的疾病具有深遠的意義,還能夠避免人工合成抗氧化劑產生的毒副作用(Hu et al. 2009)。
桑黃是一種珍貴的多年生大型藥用木腐真菌,被現代人稱為“森林黃金”。桑黃在我國已有 2 000 年的應用歷史,最早以“桑耳”之名出現在《神農本草經》上。桑黃這一名稱最早出現在唐初的《藥性論》,在明代的《本草綱目》及其他醫書也有記載,并一直沿用至今。除中國古籍記載外,朝鮮 500 年前的醫書《鄉藥集成方》和 400 年前的醫書《東醫寶鑒》皆稱桑黃如靈丹妙藥。多處古籍記載說明了桑黃作用之大,被世人所認可。
桑黃名稱及其藥用在中國流傳千年以上,在日、韓使用也達數百年,但真正的桑黃種類及學名長久以來并沒有定論。有鑒于前期真正的桑黃種類未理清,不同桑黃之間的比較研究更沒法開展。直到 2012 年吳聲華博士等通過研究發現真正的桑黃是未曾發表過的新種,分布于中國大陸、日本、韓國以及中國臺灣地區,野外僅生長在桑屬植物樹干(Wu et al. 2012)。Zhou et al.(2016)通過序列分析及形態特征將桑黃類群重新進行歸類,建立桑黃孔菌新屬,并命名為 Sanghuangporus Sheng H. Wu W. Zhou & Y. C. Dai。目前,桑黃類群包括了 13 個種,我國存在 8 個種,廣泛分布與寒溫帶至熱帶地區,但部分種類僅分布于特定區域且與特定宿主植物形成嚴格的寄生關系(朱琳和崔寶凱 2016),同時具有明顯的地域特色。吳長生(2011)對天然野生桑黃和人工培養桑黃 95%乙醇提取物進行了化學成分研究,共分離得到 57 個化合物,包括 4 個新芐基二氫黃酮。張俊峰等(2020)比較了桑黃菌絲體和子實體 4 個萃取相在抗氧化、抗腫瘤與化學成分上存在的差異,提出發酵菌絲體在抗氧化活性方面具有替代子實體的可行性。
桑樹桑黃 Sanghuangporus sanghuang 和楊樹桑黃 S. vaninii 是目前研究和開發最好的兩種桑黃。然而外觀似桑黃的種類很多,真正的野生桑樹桑黃的數量很少,如外觀類似的楊樹桑黃,在野外的數量約為桑樹桑黃的百倍,且市場價格比桑樹桑黃低很多。但是到目前為止,野生桑樹桑黃和楊樹桑黃在抗氧化活性及活性成分的差異方面鮮有系統的研究。本研究對野生桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物抗氧化活性進行比較,并對其活性成分進行系統鑒定,為其后續的開發和研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 供試材料
桑樹桑黃和楊樹桑黃子實體選用千島湖野生桑樹桑黃和楊樹桑黃。并利用 ITS 序列信息對桑樹桑黃和楊樹桑黃進行過分子生物學鑒定。經 60℃干燥、粉碎后,過 120 目備用。福林‐酚試劑(Folin‐Ciocalteu)、蘆丁、 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、丁基羥基茴香醚(BHA)、鄰苯三酚、亞油酸、β-胡蘿卜素購自 Sigma,其余化學試劑均為國產分析純或色譜純。
1.2 提取物的制備
取粉碎好的桑樹桑黃和楊樹桑黃各 50g,加入 1 500mL 70%乙醇,超聲提取 30min,提取結束后,過濾,殘渣再加入 1 500mL 70% 乙醇超聲提取一次,合并濾液,真空旋轉蒸發濃縮,進一步冷凍干燥,得到提取物。
1.3 活性成分含量測定
多酚含量 : 根據張 梅梅等( 2011) Folin-Ciocalteu方法略加改動,測定多酚含量。以沒食子酸濃度為橫坐標,波長 750nm 下吸光值為縱坐標,標準曲線的回歸方程為: y=7.7925x+0.0115,相關系數 R 2 =0.9982。
總黃酮含量:根據 Zhuang et al.(2018)的方法測定黃酮含量。以蘆丁濃度為橫坐標,波長 510nm 下吸光值為縱坐標,標準曲線的回歸方程為: y=1.927x+0.117,相關系數 R 2 =0.9935。
1.4 抗氧化活性分析
1.4.1 DPPH 自由基清除能力:取 2mL(不同濃度)樣品液置于 10mL 離心管中,加入 2mL 現配的 0.1mmol/L 的 DPPH 甲醇溶液,混合均勻后,在室溫下置于暗處靜置 30min,于 517nm 處測定吸光度(Locatelli et al. 2009)。
1.4.2 超氧自由基清除能力:取 4.5mL 的緩沖液于 10mL 具塞試管中,20℃水浴中預熱20min 后,分別加入不同濃度的提取液 1mL 和 25mmol/L 鄰苯三酚溶液 0.4mL,搖勻后用蒸餾水稀釋至刻度。置于 25℃水浴中反應 5min,取出后加入 8mol/L HCL 溶液 1mL,終止反應。于 299nm 處測定吸光度(Li 2012)。 1.4.3 β-胡蘿卜素漂白實驗:向燒瓶中加入 20mg 亞油酸,20mg 吐溫-40,然后加入 1mL β-胡蘿卜素的氯仿溶液(0.1mg/mL),45℃下旋轉真空蒸發器中蒸發掉氯仿液,然后緩慢向半固殘渣中加入 50mL 去離子水,邊加邊劇烈震搖燒瓶,形成乳濁液,備用。試管中加入 0.2mL 樣品溶液(提取物,BHA),加入 5mL 乳濁液,搖勻后在 470nm 下測定吸光度,以不含 β-胡蘿卜素的乳濁液作為空白對照,試管在 50℃水浴中放置,吸光度每 15min 測定一次,記錄至 180min(Yuan et al. 2017)。
1.5 UPLC-Triple-TOF/MS 定性分析
1.5.1 測定液的制備:桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物各 1g 溶于 30mL 70%甲醇溶液,旋轉蒸發除去甲醇后,用等量的乙酸乙酯進行萃取,乙酸乙酯萃取液蒸干后,加入 5mL 甲醇溶解,進行 UPLC-Triple-TOF/MS 定性分析。
1.5.2 色譜條件:色譜柱為沃特世 ACQUITY UPLC HSS T3(150mm×2.1mm i.d.,1.7µm);以 0.1%甲酸溶液為流動相 A,以 0.1%甲酸乙腈為流動相 B,線性梯度洗脫,0min 10%B; 2min 20% B;25min 35% B;35min 95% B; 37min 95% B;流速為 0.3mL/min;進樣量: 2µL。
質譜條件:UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液質聯用儀:負離子掃描模式;掃描范圍: m/z 100-1500;霧化氣(GS1):55psi;霧化氣(GS2):55psi;氣簾氣(CUR):35 psi;離子源溫度(TEM):550V(負);離子源電壓(IS): -4 500V(負);一級掃描:去簇電壓(DP): 100V;聚焦電壓(CE):10V;二級掃描:使用 TOF MS-Product Ion-IDA 模式采集質譜數據,CID 能量為-20、-40 和-60V。
1.6 統計方法
所有計量數據均表示為?X±SD,采用 SPSS 軟件進行單因素方差分析及 q 檢驗法進行檢驗,以 P<0.05 為顯著差異。
2 結果與分析
2.1 多酚與黃酮含量
多酚是一類芳香族衍生物的總稱,廣泛存在于植物和真菌中。它是一種很好的電子供體,通過與自由基或金屬離子等發生反應,可以阻斷脂質的過氧化作用(Martini et al. 2017)。黃酮作為穩定的自由基清除劑是在自然界中普遍存在的一類化合物(Chen et al. 2016)。
圖 1 野生桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物中黃酮和多酚的含量 數據均為測定 3 次的結果,表示為“平均值±標準差”,同一列不同字母代表數值間差異顯著(P<0.05)
野生桑樹桑黃和楊樹桑黃子實體經 70%乙醇提取,經分析,桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物中黃酮類含量分別達到了(10.18±0.85)% 和(13.58±1.33)%,多酚含量分別達到了(14.62± 1.05)%和(15.38±0.76)%。楊樹桑黃中多酚含量略高于桑樹桑黃,黃酮含量顯著高于桑樹桑黃。
2.2 DPPH 自由基清除活性
桑樹桑黃和楊樹桑黃提取液的 DPPH 自由基清除活性見圖 2。隨著濃度的增加,桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物和抗氧化劑 BHA 的 DPPH 自由基清除率先不斷增加再趨于平緩。其中楊樹桑黃提取物對 DPPH 自由基的清除率要顯著高于桑樹桑黃提取物。在濃度達到 1.6mg/mL 時,楊樹桑黃提取物與 BHA 清除效果相當。抗氧化劑主要通過兩種機制發揮作用:作為氫原子供體和作為電子供體。已知酚類物質是優良的氫原子和電子供體,并能形成穩定的自由基中間物,因此酚類物質在抗氧化活性中發揮重要作用。
2.3 超氧陰離子清除能力
不同濃度的桑樹桑黃提取物、楊樹桑黃提取物和 BHA 都具有一定的清除超氧陰離子的能力(圖 3)。在濃度為 0.1 和 0.2mg/mL 時,楊樹桑黃提取物與桑樹桑黃提取物超氧自由基的清除能力不顯著。當濃度達到 0.4mg/mL 時,桑樹桑黃提取物、楊樹桑黃提取物和 BHA 對超氧陰離子清除能力差別顯著,分別為 78.4%、84.1%和 99.0%。
2.4 β-胡蘿卜素漂白實驗
β-胡蘿卜素、亞油酸共氧化試驗中各樣品的抑制活性見圖 4。各樣品的吸光度顯著下降并最后趨于平緩。在反應的 120min 內,桑樹桑黃提取物、楊樹桑黃提取物和 BHA 的吸光度分別從 0.36、0.37 和 0.39 下降到 0.15、 0.19 和 0.27。實驗結果與其他抗氧化活性評價的結果相似,楊樹桑黃提取物的抗氧化活性顯著高于桑樹桑黃提取物。
2.5 桑樹桑黃和楊樹桑黃醇提物的化學組成比較
采用 UPLC-Triple-TOF/MS 對桑樹桑黃和楊樹桑黃乙醇提取物進行定性分析,主要依據質譜分子離子峰及離子碎片數據,結合 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索信息和文獻檢索等信息。桑樹桑黃和楊樹桑黃醇提物液相色譜圖見圖 5,主要化合物結構見圖 6。
成分 1:出峰時間為 2.51,[M-H]-為 m/z 153.0215,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C7H6O4,根據二級質譜,109 等碎片離子,推測結構中存在羧基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為原兒茶酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)。
成分 2:出峰時間為 3.24,[M-H]-為 m/z 137.0265,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C7H6O3,根據二級質譜,119、108 等碎片離子,推測結構中存在羥基和醛基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為原兒茶醛(3,4-dihydroxybenzaldehyde)。
成分 3:出峰時間為 4.13,[M-H]-為 m/z 423.0704,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C22H16O9,根據二級質譜,379、335 等碎片離子,推測結構中存在羧基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 phellibaumin B。該化合物是從暴馬丁桑黃中發現的由 hispidin 衍生的一種多酚類化合物。
成分 4:出峰時間為 5.11,[M-H]-為 m/z 177.0571,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C10H10O3,根據二級質譜,159、135 等碎片離子,推測結構中存在羰基和羥基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為桑黃素 C(4-(3,4-dihydroxyphenyl)-3- buten-2-one)。該化合物同樣擁有鄰二酚的母核結構,也具有很強的抗氧化活性。
成分 5:出峰時間為 5.67,[M-H]-為 m/z 245.0455,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C13H10O5,根據二級質譜,201、159 等碎片離子,推測結構中存在羰基、羥基等結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 hispidin。
成分 6:出峰時間為 6.98,[M-H]-為 m/z 975.1397,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C52H32O20,根據二級質譜,931 等碎片離子,推測結構中存在羧基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 phelligridimer A 或其異構體。phelligridimer A 是 hispidin 衍生物,其有很強的抗氧化作用(Wang et al. 2005)
成分 7:出峰時間為 7.34,[M-H]-為 m/z463.1016,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C25H20O9,根據二級質譜,405、379、 335、135 等碎片離子,推測結構中存在苯并乙烯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為骨碎補內酯(davallialactone)。此化合物也是也是 hispidin 衍生物,其有很強的抗氧化作用(Yang et al. 2013)。
成分 8:出峰時間為 7.62,[M-H]-為 m/z 975.1406,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C52H32O20,根據二級質譜,931 等碎片離子,推測結構中存在羧基,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,相對含量判斷,推測該化合物為 phelligridimer A。
成分 9:出峰時間為 7.87,[M-H]-為 m/z463.1014,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C25H20O9,根據二級質譜,405、379、 335、135 等碎片離子,推測結構中存在苯并乙烯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 davallialactone 異構體。
成分 10:出峰時間為 10.66,[M-H]-為 m/z489.0807,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C26H18O10,根據二級質譜,445、403、 135 等碎片離子,推測結構中存在苯并乙烯和羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 hypholomine B。hypholomine B 作為一種多酚類化合物,具有很強的抗氧化活性(Jun et al. 2008)。
成分 11:出峰時間為 12.20,[M-H]-為 m/z489.0811,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C26H18O10,根據二級質譜,445、403、 135 等碎片離子,推測結構中存在苯并乙烯和羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 hypholomine B 異構體。
成分 12:出峰時間為 13.01,[M-H]-為 m/z489.0808,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C26H18O10,根據二級質譜,445、403、 135 等碎片離子,推測結構中存在苯并乙烯和羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數 據 庫 檢 索 , 推 測 該 化 合 物 為 桑 黃 素 L(3,14’-bihispidinyl)。3,14’-bihispidinyl 作為一種 hispid 的衍生物,具有很強的抗氧化活性(Jun et al. 2008)。
成分 13:出峰時間為 13.95,[M-H]-為 m/z461.0866,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C25H18O9,根據二級質譜,417 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為纖孔菌素 A(inoscavin A)。
成分 14:出峰時間為 14.83,[M-H]-為 m/z733.1187,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C39H26O15,根據二級質譜,689、645 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 phellinstatin。Phellinstatin是擁有多個酚羥基的多酚化合物,具有很強的抗氧化活性(Jun et al. 2008)。
成分 15:出峰時間為 14.9,[M-H]-為 m/z473.0502,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C25H14O10,根據二級質譜,458、445 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為桑黃素 E(phelligridin E)。
成分 16:出峰時間為 16.02,[M-H]-為 m/z733.1187,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C39H26O15,根據二級質譜,689、645 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 phellinstatin 異構體。
成分 17:出峰時間為 16.31,[M-H]-為 m/z379.0447,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C20H12O8,根據二級質譜,335、307 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為桑黃素 D(phelligridin D)。
成分 18:出峰時間為 16.95,[M-H]-為 m/z379.0450,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C20H12O8,根據二級質譜,335、307 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,推測該化合物為 phelligridin D 的異構體。
成分 19:出峰時間為 18.71,[M-H]-為 m/z623.0814,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C33H20O13,根據二級質譜,579 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,根據相對保留時間,推測該化合物為 inonobulin A。 Inonobulin A 是一種擁有多個酚羥基的多酚類化合物。
成分 20:出峰時間為 20.83,[M-H]-為 m/z363.0502,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C20H12O7,根據二級質譜,335 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,根據相對保留時間,推測該化合物為 meshimakobnol B(Nagatsu et al. 2004)。
成分 21:出峰時間為 27.0,[M-H]-為 m/z621.0665,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C33H18O13,根據二級質譜,577 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,根據相對保留時間,推測該化合物為桑黃素 H(phelligridin H)(Zheng et al. 2011)。
成分 22:出峰時間為 28.28,[M-H]-為 m/z459.0711,根據高分辨質譜結果擬合的分子式為 C25H16O9,根據二級質譜,415、373 等碎片離子,推測結構中存在羧基或者內酯結構,根據 Scifinder 和 Reaxy 數據庫檢索,根據相對保留時間,推測該化合物為桑黃素 L(phelligridin L)(Zheng et al. 2011)。
3 討論
桑樹桑黃只生活在活體桑樹上,目前還很難栽培,野生數量也很有限;楊樹桑黃野生較多,人工栽培也已經比較成熟,市面上所謂的栽培桑黃子實體,大都是楊樹桑黃(吳聲華和戴玉成 2020)。
本研究中,桑樹桑黃和楊樹桑黃子實體選用千島湖采集的野生桑樹桑黃和楊樹桑黃,并經過形態學和分子生物學確定。采用 DPPH 方法,超氧陰離子清除實驗和 β-胡蘿卜素漂白實驗對桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物的抗氧化活性進行研究,研究發現桑樹桑黃和楊樹桑黃均具有很強的抗氧化活性,楊樹桑黃的抗氧化活性顯著強于桑樹桑黃。
桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物的抗氧化活性與其活性成分是分不開的,本研究采用UPLC-Triple-TOF/MS 對桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物中的活性成分進行了定性分析。桑樹桑黃中共鑒定出 19 種活性物質,大多數是 hispidin 的衍生物;而在楊樹桑黃提取物中,除了發現的這 19 種活性物質外,還發現了 meshimakobonl B,桑黃素 H 和桑黃素 L。這些化合物都為多酚類物質,其中大部分活性物質的抗氧化活性都有報道(Ei-Sonbaty et al. 2019;Kim et al. 1999)。研究發現這些化合物中很多都含有鄰苯二酚的母核結構,這些基團是其顯著抗氧化活性的物質基礎(Jeong et al. 2009)。Hispidin 是真菌中常見的具有抗氧化作用的多酚類化合物。以 hispidin 為關鍵前體物質合成的衍生物在大型藥用真菌中普遍存在,大部分具有較強的抗氧化、抗炎以及抗腫瘤等活性(Park et al. 2004)。
在桑樹桑黃和楊樹桑黃提取物中鑒定的化合物有多個是 hispidin 及其衍生物。因此,這些物質在桑黃提取液的抗氧化活性中起到很重要的作用。黃酮作為桑黃的標志性成分之一,有報道桑黃中的黃酮類化合物有櫻花亭、柚皮素、7-甲基圣草素、芫花素和甲基桑黃黃酮等(史幀婷和包海鷹 2016;莫順燕等 2003),但在本研究中并沒有鑒定出。陳萬超等(2020)對近 5 年從桑黃類真菌中分離得到的多酚類化合物及其活性進行了綜述,沒有典型黃酮類物質被分離鑒定出來。造成這些差異的原因一方面可能在于以前桑黃菌屬分類比較混亂,不同藥用木生真菌種類自身所具有的藥用次生代謝產物的合成基因簇不同,另一方面也可能是桑樹桑黃和楊樹桑黃自身生長狀態和寄生樹種種存在差異。
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