一、細胞培養

人結腸癌細胞系CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、LoVo均購自ATCC，并由上海消化外科研究所傳代保存。LoVo采用含10％胎牛血清的F-12K培養傳代；CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116均使用含10％胎牛血清的RPMI1640培養液，置于37℃、5％CO2的培養箱中，以1∶2至1∶4的比例傳代培養。

二、方法

1.樣本收集及免疫組化染色：結腸直腸腫瘤標本取自上海市微創外科臨床醫學中心手術室。手術標本切除后生理鹽水清洗，打開腸腔，剔除瘤體表面壞死及炎性肉芽組織；取腫瘤中心部位及距腫瘤5cm以上的正常腸黏膜全層組織，切成1cm塊狀后置入樣本管。組織標本經4%甲醛溶液充分固定后，制作蠟塊，切片、貼片。隨后采用鏈霉素親和素-過氧化酶復合物（SP）法進行免疫組化染色，DAB顯色。TMPRSS4多克隆抗體購自美國Proteintech公司，1∶50稀釋。

2.半定量RT-PCR：采用Trizol試劑（Invitrogen，美國）提取細胞總RNA。電泳鑒定RNA完整性，分光光度計260nm處測定RNA濃度，使用逆轉錄試劑盒（Takara，日本）在ABIPrismSDS7000中進行逆轉錄cDNA合成。上海吉瑪生物有限公司合成如下引物：TMPRSS4上游引物5′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′，下游引物5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′，下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。cDNA在PCR儀(AppliedBiosystems，美國)中進行反應，50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35個循環；然后，72℃10min，擴增產物于1％瓊脂糖凝膠中，130V、30min條件下電泳并在紫外燈下攝片，成像保存。

3.Western印跡法：細胞在10cm培養皿（Corning，美國）中生長融合約90%時，PBS清洗2次后加入300μLRIPA，置冰上30min裂解充分后煮沸10min，隨后13000r/min離心5min。取上清液，BCA法測定蛋白質濃度。每孔上樣量100μg，加入5×上樣緩沖液、去離子水至總體積一致后變性電泳（積層膠80V，分離膠120V），半干轉法轉膜（15V）70min后脫脂牛奶室溫封閉2h，4℃下一抗（兔抗人TMPRSS4多抗，112831-AP，Proteintech，美國，1∶600稀釋）孵育過夜。TBST洗膜3遍后加入一定比例稀釋的相應二抗室溫孵育1h，TBST洗膜2次，PBS洗膜1次后熒光發光顯色。

4.siRNA瞬時轉染：細胞生長至70%融合時胰酶消化，計數后按每孔3×105細胞鋪6孔板，過夜。24h后按照Lipofectamine2000（Invitrogen，美國）說明書操作進行細胞轉染。由上海吉瑪生物有限公司設計并合成TMRPSS4-siRNA序列：5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′（si組）。僅轉染Lipo2000的細胞為空白對照組，轉染陰性對照序列的細胞為陰性對照組（NC組）。轉染48h后用Trizol試劑提取細胞總RNA，72h提取總蛋白質。

5.CCK-8測細胞增殖：取轉染后SW480細胞計數后鋪于96孔板，每孔100個；設干擾組、陰性對照組和空白對照組，每組6個復孔。在第0、24、48、72、96和120h，分別于各孔加入CCK-8試劑（cellcountingkit-8，Dojindo,日本）10μL，37℃孵育2.5h，酶標儀測定各孔在450nm的吸光度值。以時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

6.AnnexinⅤ/PI流式檢測細胞凋亡：轉染48h后收細胞，取100μL細胞懸液（1×106個/mL）至流式管，用PBS洗滌1次，離心后加入300μL結合緩沖液，混勻，再加入5μL的AnnexinⅤ-FITC和5μL的PI，孵育15min后用流式細胞儀（BD，美國）上機檢測。

7.劃痕試驗：6孔板轉染，待細胞鋪滿后，用無菌槍頭每孔筆直劃線，PBS清洗3次，加入無血清培養液置培養箱孵育。24h后在顯微鏡下每孔隨機選取視野觀察攝片。

8.transwell遷移試驗：取轉染24h后細胞，無血清RPMI1640培養液重懸后計數，調至終密度為5×105個/mL。24孔板每孔內加入900μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，隨后置入transwell小室（Corning，美國），小室內加入200μL細胞懸液（105個細胞）。培養箱孵育24h后取出，棉簽拭去內室面細胞，甲醇固定小室外穿出細胞10min，1%結晶紫染色10min，PBS清洗3遍后，顯微鏡下觀察攝片。

三、統計學方法

采用SPSS11．0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗。P<0．05為差異有統計學意義。

1.免疫組化檢測TMPRSS4蛋白在結腸直腸癌組織和正常腸上皮中表達標本免疫組化染色顯示，TMPRSS4蛋白定位于細胞膜上，在腫瘤組織和轉移淋巴結中均染色陽性，且轉移淋巴結中TMPRSS4蛋白染色更強。表明TMPRSS4表達可能與腫瘤細胞遷移能力有一定相關性。

2.半定量RT-PCR和Western印跡檢測TMPRSS4在結腸癌細胞株中的表達通過半定量RT-PCR檢測發現，TMPRSS4基因在7株結腸癌細胞中有不同程度的表達，其中在HT29、SW480、SW620、SW1116中的表達相對較高。Western印跡檢測亦有類似結果，有細胞均不同程度表達TMPRSS4蛋白，而HCT116、SW480和SW1116蛋白表達量相對較高。因此，本研究決定選用SW480細胞進行下一步試驗。三、siRNA瞬時轉染后SW480細胞中TMPRSS4蛋白表達下調在轉染siRNA48h后，Western印跡法檢測發現，與空白對照組和NC組相比，siRNA干擾組（si組）的TMPRSS4蛋白表達明顯下降。

3.TMPRSS4下調可顯著抑制SW480細胞的增殖能力siRNA處理SW480細胞株后，采用CCK-8法測定細胞增殖能力。在第1、2、3、4、5天不同時間點分別測定吸光度值，吸光度值可間接反映細胞增殖能力的強弱。與空白對照組和NC組相比，si組細胞增殖能力在48~96h時受到明顯抑制（P<0.05)。

4.下調TMPRSS4誘導SW480細胞凋亡SW480細胞株轉染TMPRSS4siRNA后孵育48h，收集細胞，用AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測細胞周期，si組細胞凋亡比值為14.0%，而空白對照組和NC組分別為10.4%和10.1%，有統計學差異（P<0.05）。提示下調TMPRSS4可能有誘導結腸癌細胞凋亡的作用。

5.siRNA干擾TMPRSS4表達顯著影響SW480細胞的遷移能力采用siRNA處理SW480細胞后，進行細胞劃痕及transwell遷移試驗。結果顯示，si組的SW480細胞在劃痕試驗中的運動能力比對照組顯著降低(P<0.05)；si組在transwell試驗中的穿膜細胞數亦比對照組顯著降低(P<0.05)。

四、討論

Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶是一類新近發現的特殊蛋白酶，具有明顯的組織表達特異性，且與耳聾、貧血、高血壓和腫瘤等的發生相關。本研究探討該家族成員TMRPSS4在結腸直腸癌組織中的表達及其對增殖、凋亡、遷移等方面的影響。采用siRNA干擾TMPRSS4表達后，發現腫瘤細胞的增殖能力減弱，同時細胞運動遷移能力也降低，這與Jung等先前的研究結果相一致。針對該蛋白質的其他研究表明，TMPRSS4可能通過作用于細胞間黏附分子或激活其他蛋白酶在組織發育和細胞分化中發揮重要作用；并通過發揮其蛋白酶的水解作用裂解病毒表面的紅細胞凝集素，促進病毒在肺部的擴散而致病。因此，推測該基因可能通過靶向作用于細胞外基質及細胞-細胞間連接分子而在調控SW480細胞的增殖及遷移中發揮作用，具體機制尚有待后續研究來揭示。同時，流式細胞凋亡檢測顯示，在siRNA干擾后，SW480細胞的凋亡比例明顯增加，這與干擾后細胞的增殖能力降低相一致，表明敲除TMPRSS4基因可能通過誘導細胞凋亡而抑制增殖。最近有研究表明，乳腺癌中TMPRSS4表達與淋巴結轉移、病理分期差、腫瘤體積大以及總生存率和無病生存率低相關。本研究初步顯示，TMPRSS4在結腸直腸癌組織和轉移淋巴結中有不同程度表達，且轉移淋巴結染色強度略高。因此，有必要進一步探討TMPRSS4與結腸直腸癌病理分期、分級、淋巴結轉移及病人預后間的相關性，為其作為預后預測因素提供依據。我們將繼續探討TMPRSS4對于結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲方面的具體作用機制，揭示這一基因對于結腸直腸癌發生、發展的作用。

作者：黃傲 周厚民 趙紅超 全應軍 金潤森 樂飛 馬君俊 馮波 鄭民華 單位：上海交通大學青島市市立醫院