草莓脯貯藏期間非酶褐變的化學途徑分析

　　摘 要：為確定貯藏期間草莓脯褐變的化學途徑，將商業生產的同批次草莓脯分別于 37 ℃、25 ℃、4 ℃ 條件下貯藏，測定了色澤參數 L*、a*、b*以及抗壞血酸、總酚、3 種游離糖、5 種游離氨基酸和 5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量，并進行了相關性和聚類分析。結果表明：隨著貯藏時間延長，三個溫度下 L*、a*、 b*均呈下降趨勢，總色差△E 達 5.60 ~ 33.33, 說明色澤發生了顯著變化;抗壞血酸、總酚、游離糖和氨基酸含量也出現不同程度的下降，其中抗壞血酸下降幅度最大;5-HMF 含量則呈線性上升。相關性分析顯示除天冬酰胺外，其他色澤及化學指標與△E*均顯著相關(P < 0.05)，說明色澤變化可能來自于抗壞血酸降解、多酚氧化和美拉德等途徑的共同作用。聚類分析則將樣品分為兩類，較高溫度、較長時間貯藏的樣品與其他樣品得以區分，說明溫度與時間對褐變程度的影響不可忽略。總之，在草莓脯貯藏期間的褐變中，同時存在抗環血酸、酚類、糖和氨基酸參與的褐變反應，但各成分含量變化與褐變程度存在不同步性。結果將為草莓脯貯藏期間的褐變控制提供借鑒。

　　關鍵詞：草莓脯;貯藏;非酶褐變;理化指標;相關性分析

　　牛麗影;胡麗麗;李大婧;劉春菊;張鐘元 食品科學 2021-12-05

　　草莓脯是近年來的新興果脯，但草莓脯貯藏過程中會發生褐變，影響其商品價值和產品形象。褐變是食品貯藏和加工中普遍存在的現象，可分為酶促褐變和非酶促褐變，加工后的食品則以非酶促褐變為主，非酶褐變的化學機制一般包括抗壞血酸降解，酚類物質的氧化聚集，美拉德反應，糖的裂解等，直接參與非酶褐變的化學成分往往包括抗壞血酸、還原糖、多酚、氨基酸等[1]。另外，5-羥甲基糠醛(5-HMF)作為非酶褐變的中間產物也一直廣受關注，它來自于六碳糖的烯醇化、脫水、環化反應以及美拉德反應中的 amadori 重排[2, 3]。食品成分復雜，其非酶褐變往往為多種途徑的共同作用，不同食品在不同的加工條件及貯藏環境下，造成褐變的主要途徑和關鍵控制點不同，如 Paravisini 和 Peterson[4]認為美拉德反應是橙汁褐變的主要途徑，關鍵成分有葡萄糖、色氨酸和谷氨酸;Wang 等[5] 則認為控制東北酸菜的褐變問題應抑制抗壞血酸氧化降解和多酚氧化聚合兩個途徑。

　　果脯為我國傳統食品，通過糖漬干燥等工藝，使水果保存期延長。近年來，消費市場對果脯產品提出了低糖、無硫、天然色的健康營養新要求[6-8]，給果脯類食品的色澤控制技術帶來新的挑戰。但目前對果脯褐變的研究仍多為護色工藝優化[7, 8]，在機理與工藝結合角度仍待深入。果脯的種類很多，草莓脯作為新型果脯品類，僅有制作方法的介紹[9]，對其品質變化研究幾乎空白。草莓鮮果含有豐富的抗壞血酸、多酚(花青素等)以及還原糖和氨基酸類[10,11]，這些成分均為褐變研究中廣受關注的化學物質，但是這些成分在草莓脯中如何變化并在褐變中發揮什么作用尚未見報道。為探明草莓脯貯藏期間褐變的發生發展與溫度、時間的關系以及內在化學成分變化機制，本文對不同溫度貯藏期間草莓脯的色澤以及抗壞血酸、還原糖、多酚、氨基酸、5-HMF 含量變化進行了測定，對色澤及化學成分變化的關系進行了分析，并采用相關性分析和相似性聚類對關鍵途徑進行了探討。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　市場采購同品牌同批次草莓脯，采用 9cm×13cm+3cm 規格磨砂(材料 BOPP+PET+PE)自封袋分裝，每袋 15 顆草莓脯，密封后分別置于 37℃，25 ℃， 4℃保存，試驗起始日期滯后生產日期 10 天。至設定貯藏日期取出草莓脯，剪碎后真空凍干，待分析用。色譜純甲醇 德國 Merck 公司;色譜純乙腈 美國 TEDIA 公司;氨基酸混合標樣 美國 sigma 公司; 3-巰基丙酸、乙醇、偏磷酸、二水合磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛(OPA) 國藥集團化學試劑有限公司。

　　1.2 儀器與設備

　　FD-1A-50 真空凍干機(上海比朗儀器有限公司);WSC-S 型色差儀(上海精密科學儀器有限公司);美國 Agilent 公司 1200 型高效液相色譜儀(配有二極管陣列及示差檢測器);DNP-9052BS-Ш 電熱恒溫培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司);H3-16KR 臺式高速冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司);LBI-150 生化培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 色差的測定

　　采用色差儀測定 L*、a*、b*值，每次測定 6 個草莓脯作為重復。另計算△E*表示總色差的大小，其計算公式為△E*=(△L* 2+△a* 2+△b* 2)1/2，其中△L*、△a*、△b*分別為測定值與初始值之間的差值。△E*越大，表明樣品色澤與初始狀態差別越大。

　　1.3.2 抗壞血酸的測定取 1.0 g 草莓脯樣品于 10 mL 離心管中，加入少量預冷的 0.25% 的偏磷酸冰浴浸提，然后用 0.25% 的偏磷酸定容至 10 mL，在 4 ℃下 10, 000 r/min 離心 10 min，取上清液，上清液經 0.45µm 微孔濾膜過濾后待測。液相色譜測定條件：色譜柱為 ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流動相為 0.03 mol/L 正磷酸，流速為 0.8 mL/min，柱溫 25℃，檢測波長 240 nm，進樣量 20 μL。

　　1.3.3 總酚的測定取 2.0 g 草莓脯樣品，加 5.0 mL Folin - Ciocalteu 試劑混勻，靜置 4 min 后加 4.0 mL 7.5 g/100mL 的 Na2CO3 溶液，室溫避光放置 60 min 后，765 nm 處測定吸光值，以沒食子酸做標準曲線，結果表示為每克凍干草莓脯含有沒食子酸等效物質量( mg /g) 。

　　1.3.4 游離糖和游離氨基酸的測定樣品處理：取草莓脯 1.0 g，加入 2 mL 蒸餾水進行研磨，用 5 mL 蒸餾水分三次沖洗研缽，將草莓脯漿液轉移至容量瓶并定容至 10 mL，60 ℃超聲處理 40 min。超聲處理后混勻移 5.0 g 至 10 mL 離心管，4 ℃下 10,000 r/min 離心 10 min，取上清液用 0.45 µm 的微孔濾膜過濾后 -18 ℃冷凍保存，待液相色譜測定。游離糖的測定：色譜柱為 Carbohydrate 色譜柱( 150.0 mm × 4.6 mm，5 μm) ，檢測器為示差(RID)檢測器，流動相為乙腈:水(75:25, V/V)，柱溫設為 30 ℃ ，進樣量 20 μL，流速為 0.8 mL/min。游離氨基酸的測定：色譜柱為 ZORBAX Eclipse-AAA(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，檢測器為二極管陣列(DAD)檢測器。樣品的 OPA 衍生及色譜條件參照文獻[12]進行。定性定量方法：通過與糖及氨基酸標準樣品比對進行定性，外標法定量。

　　1.3.5 HMF 含量的測定樣品預處理：取 1.0 g 草莓脯，加 2.0 mL 甲醇水混合液(1:9, V/V)研磨，60 W 超聲 30 min 后取出。于 4℃下 8000 r/min 離心 10 分鐘，取上清液通過 0.45μm 的微孔濾膜，待液相色譜分析用。液相色譜測定條件：色譜柱為 ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流動相為甲醇：水(1 : 9, V/V)，柱溫設為 35 ℃，進樣量為 20 μL，流速為 0.8 mL/min。

　　1.4 數理統計采用 JMP 10.0 進行單因素方差分析、相關性分析與聚類分析。差異顯著水平 P<0.05。相關性分析為 Pearson 相關，雙向聚類采用標準化數據進行色圖繪制和 ward 法聚類。

　　2 結果與分析 2.1 不同貯藏溫度下草莓脯的色澤變化

　　色差計測定的表色參數中，L*為亮度值，其值越大表明表示物體亮度越高;a*為紅值，a*>0 表示偏紅，a*<0 表示偏綠;b*>0 表示偏黃，b*<0 表示偏藍。由圖 1 可以看出，草莓脯初始色澤中 L* 較高，a*、b*均為正值，總體呈現明亮的紅色。食品貯藏中 L*下降表示亮度降低，往往表征樣品存在褐變現象，但是不同食品褐變過程中三個參數的變化規律并不相同。在蜂蜜[13]、蘋果醬[14]貯藏過程中褐變表現為 L*、b*下降但 a*值上升;荔枝的紅色果皮貯藏 6 天中發生褐變，表現為 L*、a*、b* 全部下降 [15]。草莓脯貯藏過程中，L*、a*、b*值均呈下降趨勢，并且溫度越高變化越快，變化程度最大的 37 ℃下貯藏 90 天，L*、a*、b*值分別下降為初始值的 64.46%、17.95%和 21.07%。25 ℃和 4℃下變化較慢，即便延長貯藏至 150 天，參數值仍高于 37℃貯藏 90 天時，L*下降為初始值的 64.81% 和 74.37%，a*下降為初始值的 22.79%和 60.51%，b*下降為初始值的 37.22%和 35.53%。這種溫度越高，變化越快的現象與蜂蜜、果汁等食品[13-15]一致。由以上數據還可以看出，三個參數對溫度變化的敏感度不同，其中 a*對溫度差異最為敏感即對于貯藏時間相同的樣品，不同溫度間差異最大。

　　另外，從總色差值△E*的變化來看，三個溫度下△E*均隨時間延長呈現上升趨勢，△E*增加說明色澤變化越來越明顯。相比初始值，37 ℃下貯藏 90 天時△E*達 33.33，25 ℃和 4 ℃下貯藏 150天時△E*分別為 30.51 和 20.99，均大于報道中貯藏后蜂蜜(△E< 7)[13]和蘋果醬(△E< 20)[14]的總色差值，這說明草莓脯色澤在貯藏期發生了顯著變化，也說明草莓脯貯藏期間的色澤控制是非常有必要的。

　　2.2 不同貯藏溫度下草莓脯抗壞血酸及總酚含量變化

　　抗壞血酸和酚類物質是草莓中備受關注的具抗氧化功能的活性成分，其中抗壞血酸極易降解，往往作為食品新鮮度的標志性成分[16]。食品中抗壞血酸和總酚在貯藏期間含量往往會逐漸降低，并且溫度越高降低越快[17-19]。由圖 2 可以看出，草莓脯中抗壞血酸和總酚含量在貯藏初期迅速下降，隨后下降速度減緩，并且貯藏溫度越高，下降幅度越大，與以往對果蔬汁的研究一致[17-19]。草莓脯中抗壞血酸在 37 ℃、25 ℃和 4 ℃ 貯藏 90 天時分別降至初始值的 1.07%、16.16%、25.44%，總酚則分別下降至初始值的 25.61%、32.23%、39.18%，與橙汁[17-18]、西梅汁[19]和草莓汁[20]相比，草莓脯中抗壞血酸和總酚的損失率更高，雖然這種差異與包裝等外界因素有關，但仍說明果脯作為一種有效延長水果食用期的加工產品，其貯藏過程中的營養成分損失是值得重視的。另據報道，果汁貯藏初期抗壞血酸和總酚下降速度最快與其中溶解氧的消耗有關，而后期降解則與包裝材料的氧阻隔性有關[17,18]，因此，普通密封包裝(未采取除氧措施)的草莓脯貯藏過程出現的這種抗壞血酸和總酚初期下降速度快，后期減緩的特點也有可能與包裝中氧氣的存在與消耗有關。在果汁生產往往通過脫氣或充氮等方法來減少氧化作用，因此是否可以通過避免與氧的接觸來控制草莓脯的褐變程度也是值得探討的。

　　2.3 不同貯藏溫度下草莓脯游離糖及氨基酸含量變化

　　草莓中的游離糖主要有果糖、葡萄糖和蔗糖[10, 21]，草莓脯中的糖也主要為這三種糖(表 1)。在貯藏過程中，三種糖隨時間延長均表現為下降趨勢，37 ℃和 25 ℃下貯藏初期迅速下降，30 天時果糖、葡萄糖和蔗糖三者含量為初始值的 25.18% ~ 59.01%，隨后下降速度變緩，60 天時三種糖含量為 30 天的 83.67% ~ 96.37%。在 4 ℃下，三種糖的降解較慢，30 天時果糖與初始值無顯著差異，葡萄糖和蔗糖含量則顯著高于 37 ℃和 25 ℃下貯藏 30 天時含量值。不同溫度下蔗糖含量在相同貯藏天數時均存在顯著差異，表現為 37 ℃ < 25 ℃ < 4 ℃，說明溫度越高，變化越快。但是，三個溫度下果糖和葡萄糖的變化均出現了平臺期，即 37 ℃下 30 ~ 75 天，25 ℃和 4 ℃下 90 ~ 120 天，同一溫度下隨時間延長差異不顯著。果汁中果糖和葡萄糖含量在貯藏過程中往往變化不顯著甚至含量上升，是因為蔗糖分解為果糖和葡萄糖，彌補了果糖和葡萄糖的損失[22]。本研究中草莓脯貯藏期間蔗糖呈下降趨勢，但果糖和葡萄糖在初期的下降后，出現了一段平臺期即在一定時間內含量變化差異不顯著，而且貯藏溫度越高，此平臺期出現的越早，說明草莓脯貯藏過程中同樣存在蔗糖降解為果糖和葡萄糖的過程，并且溫度越高蔗糖降解速度越快，對果糖和葡萄糖含量的補充越快?？傮w而言，葡萄糖的損失最為嚴重，三個溫度下至測試結束時含量為初始值的 5.68%~16.47%，而果糖為 17.74%~27.24%，蔗糖為 17.58%~23.12%。

　　游離氨基酸的降解在橙汁[4]、濃縮胡蘿卜汁[23]、濃縮梨汁[24]等食品貯藏中均有報道，不同果汁中氨基酸總量損失可達 60%以上，但是對于單一氨基酸而言，不同氨基酸的變化規律不同。草莓脯中僅檢測到 5 種游離氨基酸(表 1)，分別為天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸，與草莓鮮果氨基酸的組成[10]類似，五種氨基酸中含量最高的為天冬酰胺。由表 1 可看出不同溫度下，氨基酸的變化趨勢不同，37 ℃和 25 ℃下 5 種氨基酸含量隨時間延長均表現出下降趨勢，除天冬氨酸外， 37 ℃的下降幅度均大于 25 ℃。但是在 4 ℃貯藏時，5 種氨基酸則表現出先下降后上升的變化特點，尤其是天冬酰胺和丙氨酸甚至在貯藏 150 天時含量甚至高于初始水平。另外，5 種氨基酸中下降幅度最大的為谷氨酰胺，以 25 ℃貯藏為例，150 天時天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丙氨酸分別降至初始水平的 12.33%、23.3 4%、2.63%、34.40%，而谷氨酰胺僅為 1.53%。

　　食品中糖和氨基酸作為褐色成分的前體物，其含量變化一直廣受關注。其中具有羰基結構的果糖、葡萄糖等還原糖和具有氨基結構的氨基酸等化學成分通過聚合、縮合等美拉德反應歷程，可生成棕色甚至黑色大分子物質。據報道，影響甘蔗汁色值的首要因素為果糖，其次為賴氨酸[25];橙汁貯藏中發生褐變，葡萄糖、谷氨酰胺和色氨酸可能發揮了重要作用[4]。貯藏期間草莓脯的游離糖中以葡萄糖降幅最大，氨基酸中則以谷氨酰胺含量下降幅度最大，這種變化與橙汁[4]類似，這是否預示草莓脯的褐變機理與橙汁相似仍待深入驗證。

　　2.4 不同貯藏溫度下 5-HMF 含量變化

　　5-羥甲基糠醛(5-HMF)是葡萄糖或果糖在酸性條件下脫水分解產物，是美拉德反應、焦糖化反應及抗壞血酸氧化分解反應共同的中間產物，可參與美拉德反應的后階段生成褐色物質[3-5]。5-HMF 往往與食品褐變程度顯著相關，并作為預測褐變速度的指標[26]。如圖 3 所示，草莓脯貯藏過程中 5-HMF 含量三個溫度下均呈線性增加，溫度越高增加越快，37 ℃下增長速度分別為 25 ℃和 4 ℃的 26.91 倍和 293.76 倍。不同溫度下 HMF 的生成速度差別如此之大說明控制溫度在控制草莓脯褐變中非常重要，這與在甘蔗汁美拉德褐變研究中認為溫度是影響最大的因素一致[25]。但由于 5-HMF 具有多種前體物及形成途徑，因此探究草莓脯貯藏過程中 5-HMF 形成的主要途徑對于控制其褐變具有重要意義。

　　2.5 色澤變化與化學指標的相關性

　　為更好的發現色澤變化與化學指標的關系，進行了相關性分析。圖 4 為色澤、抗壞血酸和總酚含量、游離糖和氨基酸、5-HMF 各項理化指標相關性系數 r 的聚類色圖。由圖中可以看出，色澤參數 L*、a*、b*、△E*兩兩之間顯著相關(P < 0.01)，說明幾個參數在表征色澤變化時具有一致性，其中△E*與三個色澤參數之間的相關性均達到極顯著水平(P < 0.001)。以△E*來表征總色澤變化，發現與其顯著相關的化學指標有抗壞血酸和蔗糖(P < 0.001)，其次為多酚、5-HMF 和葡萄糖(P < 0.01)，然后為天冬氨酸、果糖、精氨酸、丙氨酸和天冬酰胺(P < 0.05)。也就是測定的 11 個化學指標中僅與谷氨酰胺的相關性不顯著。但是，谷氨酰胺與 L*、多酚和抗壞血酸顯著相關(P < 0.05)。據報道 [27]，抗壞血酸的降解可分為有氧降解與無氧降解，其無氧降解主要經過水解、脫羧、脫水和成環等步驟生成二羰基化合物，可與氨基酸發生羰氨縮合等反應生成有色物質;在有氧條件下則裂解為高反應活性的小分子化合物，可與其他成分進一步反應生成褐色大分子化合物?？箟难崾遣葺A藏過程中變化最快的成分，與 3 個色澤參數、3 個游離糖、3 個氨基酸(天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸)、 5-HMF 均表現出顯著的相關性(P < 0.05)，說明其與褐變反應密切相關，可能發生了有氧降解、無氧降解以及與氨基酸的羰氨縮合等多途徑反應。3 個游離糖與 3 個色澤參數、抗壞血酸、總酚兩兩間表現為顯著相關(P < 0.05)，但與除天冬氨酸外的其他 4 個氨基酸和 5-HMF 相關性不顯著，說明還原糖參與的美拉德反應造成的褐變與整體色澤變化存在不一致性。總體而言，根據色澤指標與各成分間的相關性，可以認為抗壞血酸、酚類物質、糖及氨基酸均參與了草莓脯褐色物質的生成，但不同反應途徑具有不同步性。

　　對測定的指標和樣品雙向聚類的結果如圖 5。三個溫度下不同貯藏期的 15 個樣品聚為兩類：4 ℃ 下貯藏的 5 個樣品、25 ℃下貯藏時間較短(30 ~ 90 天)的 3 個樣品與 37 ℃下貯藏 15 天及 30 天的 2 個樣品聚為類別 I;其他 5 個樣品聚為類別 II。所有指標可以分為 4 組：1)L*、抗壞血酸、總酚、 b*、谷氨酰胺;2)a*、天冬氨酸、果糖、蔗糖、葡萄糖;3)天冬酰胺、精氨酸、丙氨酸;4)△E*與 5-HMF。兩種類別的主要區別在于類別 I 中的樣品第 1~3 組指標值較高(紅-黑色為主)，△E*與 5-HMF 作為第 4)組指標紅色區域僅分布于 37 ℃下貯藏 60 ~ 90 天的 3 個樣品與 25℃下貯藏 120 天及 150 天的樣品中，體現了 5-HMF 含量變化與整體色澤變化具有一定的同步性，并具有溫度敏感性。 5-HMF 的這種變化特點說明其含量的增加可能來自于幾種不同褐變途徑的疊加。

　　3 結論與討論

　　本文通過對不同溫度下草莓脯貯藏過程中色澤變化和成分變化的研究，發現隨貯藏時間延長， 37 ℃、25 ℃、4 ℃下草莓脯 L*、a*、b*值均呈下降趨勢，5-HMF 則線性上升，說明草莓脯貯藏過程中存在明顯的褐變現象。果糖、葡萄糖和蔗糖三種游離糖中蔗糖隨時間延長呈下降趨勢，而果糖和葡萄糖則出現了平臺期，說明可能存在蔗糖分解為果糖和葡萄糖的反應。五種氨基酸在 37 ℃和 25 ℃ 貯藏呈下降趨勢，但在 4 ℃時則先下降后上升，說明溫度對氨基酸與糖的美拉德反應途徑影響較大?？傊?，色澤參數與 5-HMF 的線性變化可能是抗壞血酸和酚類的氧化反應以及美拉德反應等褐變途徑的綜合作用。

　　食品貯藏過程中廣泛存在非酶褐變，但相關化學成分的變化趨勢與主要途徑因食品特點而異。柑橘汁在貯藏過程中抗壞血酸呈直線下降，與褐變顯著相關，因此抗壞血酸的降解被認為是褐變的主要途徑[28]。草莓脯中抗壞血酸和酚類氧化可造成褐變，另外果糖、葡萄糖、天冬氨酸等做為美拉德反應的主要組分也呈現下降趨勢，因此可以判斷在草莓脯貯藏褐變中，同時存在氧化褐變和美拉德褐變兩種途徑。較高溫度下貯藏時間較長的樣品通過聚類分析與其他樣品得以區分，說明溫度和時間為影響褐變程度的重要外界因素。抗壞血酸和多酚與草莓清除自由基和抗氧化能力等營養特性顯著相關[29]，而糖與氨基酸又是重要的風味成分[30]，這些成分的降解不僅導致褐變，還會降低草莓脯的營養風味品質，因此如何針對性地采取措施，如抗氧化處理與包裝方式改進，將對草莓脯的品質提高及產業升級具有重要意義。