分析超速離心技術在蛋白質研究中的應用

　　摘 要：分析超速離心技術(analytical ultracentrifugation，AUC)是檢測生物大分子溶液中生物物理性質的重要技術，利用沉降速率(sedimentation velocity, SV)和沉降平衡(sedimentation equilibrium, SE)方法，通過紫外/可見光、干涉光以及熒光檢測器來記錄樣品池中生物大分子徑向濃度分布，以獲得其水力學、生物物理學特性。該文介紹了分析超速離心技術的產生與發展、測試原理與數據分析方法，列舉了分析超速離心技術在蛋白質性質分析、蛋白質與生物分子間相互作用測定、蛋白質結構解析以及蛋白類生物類似藥分析中的應用實例，并展望了其在蛋白質研究中的應用與發展前景。

　　李冬冬; 褚文丹; 李文奇， 實驗技術與管理 發表時間：2021-07-29

　　關鍵詞：分析超速離心技術;沉降速率;沉降平衡;蛋白質研究

　　分析超速離心技術(AUC)是通過記錄生物大分子在溶液中的沉降行為來表征其生物物理學性質的一項經典技術，在生命科學、尤其是蛋白質科學研究中具有廣泛應用。利用分析型超速離心機的紫外/可見光、干涉光以及熒光檢測方法，進行沉降速率(SV)或沉降平衡(SE)兩種模式的實驗，可獲得蛋白質的分子量、純度、聚集狀態以及生物分子間相互作用等信息，在蛋白質研究中發揮重要作用。目前，分析超速離心技術已成為蛋白質研究中必不可少的技術手段。

　　1 分析超速離心技術的產生及發展

　　1924 年，Svedberg 設計發明了第一臺分析超速離心機，用來分析膠體的尺寸與分布情況，因此獲得了 1926 年的諾貝爾化學獎[1-3]。同期，Svedberg 利用分析超速離心技術分析測定了蛋白質的沉降系數和分子量，擴展了分析超速離心技術的應用范圍，開啟了該技術在生物大分子領域中的應用[4-5]。1953 年，沃森與克里克提出了 DNA 的半保留復制機制猜想[6]。1957 年，Meselson 和 Stahlf 等利用分析超速離心技術分析了復制過程 DNA 的構象特征，驗證了 DNA 半保留復制機制，這一經典案例被稱為生物學界“最漂亮的實驗”[7]。

　　1947 年，貝克曼公司生產的分析超速離心機 Model E，促進了分析超速離心技術在生物大分子方面的應用。然而，Model E 體積龐大、操作及維護非常復雜，限制了分析超速離心技術的進一步發展。直至 21 世紀初，貝克曼公司推出了新型號分析超速離心機 ProteomeLab XL-A/I。隨后，Aviv Biomedical 公司開發了與分析超速離心機配套的商業化熒光檢測器及軟件。隨著計算機數據處理能力的提高，尤其是美國國立衛生研究院 Peter Schuck 實驗室對分析超速離心技術數據處理理論模型的改進，使得其在蛋白質研究中的應用得到了極大的促進和發展[8-10]。2017 年，貝克曼公司推出了最新型號的分析超速離心機 Optima AUC，數據檢測穩定性更強，儀器操作也更加簡便。該技術發展歷程概述如圖 1 所示。

　　2 分析超速離心技術的原理與方法

　　2.1 分析超速離心機的組成

　　分析超速離心機主要由動力系統和光學檢測系統組成[11]。

　　動力系統包括驅動系統、真空系統、控制系統、防護系統、轉子和樣品池;前 4 部分與制備型超速離心機類似，但轉子和樣品池為分析超速離心機所特有。其中，轉子的材質為鈦合金，按樣品個數不同分為 4 孔的 An-60Ti 和 8 孔的 An-50Ti 兩種型號。樣品池由中心件、藍寶石(或石英)窗口、墊片、螺絲和外殼組成，是分析超速離心機中唯一與樣品接觸的部件。

　　光學檢測系統有 3 種，分別為紫外/可見光吸收檢測器、干涉光檢測器和熒光檢測器，目前應用較廣泛的是前兩種檢測器，熒光檢測器的應用正在迅速發展中[12]。

　　紫外/可見光吸收檢測器與常用的紫外分光光度計原理類似，當樣品在某波長內有吸收時，記錄離心過程中樣品在轉子徑向上不同位置的吸光度，完成檢測。

　　干涉光檢測器應用了光的干涉作用，當光透過參比液和樣品時，由于二者的折射率不同導致光程變化，在收集器上等光程的點發生位移，干涉條紋位移距離與溶質濃度成正比。通過監測干涉條紋位移情況，可以獲得溶質濃度在轉子徑向上隨時間的變化。干涉光數據利用 CCD 相機進行收集，可以在瞬間完成，效率更高。

　　熒光檢測器內部光學部件的組裝與共聚焦顯微鏡的光學元件相似，通過二極管激光器發射出 488 nm 的激發光，經過一系列的光學元件，最終產生波長為 505~565 nm 的發射光到達光電倍增管(PTM)。PTM 接收到的發射光信號與樣品在轉子徑向位置的函數關系，可以作為進一步分析處理的實驗數據。與紫外/ 可見光吸收檢測器、干涉光檢測器相比，熒光檢測器在靈敏度及樣品選擇范圍上都得到了提高。但是，熒光檢測器需要樣品中熒光基團的配合，會在一定程度上干擾分析物的天然特性[3]。

　　2.2 分析超速離心技術的基本原理

　　在分析超速離心機運行時，樣品池中的溶質懸浮于溶液中并在離心場作用下運動，受到的作用力分別為：離心力 Fs，浮力 Fb 和摩擦力 Ff，當 3 者達到平衡，溶質進行速度為 u 的勻速沉降運動。由力學公式： 2 2 s b A A f 0 o M M F F F r r fu N N ? ? ?? ? ? ? ?? ? (1)其中，M 為溶質顆粒質量，NA 為阿伏伽德羅常數， ω為轉頭角速度，r 為旋轉軸心至界面的徑向距離， ω2 r 為離心加速度， ?o 為溶劑密度， p ? ?1/ ? 為微分比容(partial specific volume)，?p 為蛋白質常數 f 為摩擦系數。

　　得到：? ? 0 2 A u M 1 r N f ???? ? (2)定義沉降系數 s，單位為 S(Svedberg，1S=10–13s)： 2 u s ? r ? (3)由 Einstein-Stokes 關系： B B h 6π kT kT D f ?R ? ? (4)其中，D 為擴散系數，kB 為波爾茲曼常數，T 為絕對溫度，? 是溶劑粘度，Rh 為流體力學半徑。因此，由以上公式得到： 0 MD(1 ) s RT ??? ? (5)其中， ?0 為溶劑密度， R kN ? B A 為氣體常數，式(5)即為 Svedberg 方程。

　　顆粒置于離心場中在離心力作用下沉降，考察樣品池中與轉軸距離為 r，長度為 a，厚度為 dr 的體積元(如圖 2 所示)，溶質通過 A 面是沉降與擴散的綜合結果。

　　可以得到在單位時間內沉降的凈溶質量 ms ： d s 2 · d m c ra u c ar s r t ? ? ? ? ?? ? ? ? (6)其中， c 為距離 r 處的溶質濃度，? 為有效微分比容。在單位時間內擴散的凈溶質量 mD ： D d d m c D ar t r ? ?? ? ? ?? (7)因此，單位時間內體積元的溶質改變量為： d 2 d m c ar cs r D t r ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? (8)另一方面，體積元內溶質隨時間的變化為： d /d d 1 d d c mV m t t t ar r ? ? ?? ??? ? (9)代入上式即得到 Lamm 方程： c c 1 2 D s rr trr r ??? ? ? ?? ? ?? ? ? ?? ? ?? ??? ?? (10)當 s 和 D 不隨溶質濃度發生變化，式(10)可寫作 2 2 2 1 2 c cc c D r cs t rr r r ?? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ??? ?? ?(11)通過 Lamm 方程可以認識到，溶質濃度隨時間和距離的變化由沉降和擴散兩方面決定。在沉降速率實驗中，解式(11)就可以獲得 s 和 D，再與 Svedberg 方程結合，可以得到溶質的分子量 M。在沉降平衡實驗中，溶液中溶質濃度不再隨時間發生變化，式(10)等式為 0，方程有精確解，可以獲得精確度較高的分子量 M[8-10,13]。

　　2.3 分析超速離心技術的實驗方法與數據處理

　　分析超速離心技術兩種經典的實驗方法分別是沉降速率法和沉降平衡法。

　　沉降速率實驗是在較大的離心力作用下，樣品在較短時間內全部沉降到樣品池底部，在不同時刻收集的數據可以反映該時刻在不同徑向位置的溶質濃度，通過解析 Lamm 方程和 Svedberg 方程可以得到沉降系數 s、擴散系數 D 和分子量 M 等信息[14]。沉降平衡實驗是在較低的轉速下，不同濃度的樣品分別在不同轉速下達到沉降與擴散的平衡，對沉降平衡數據進行整體分析(global analysis)后得到分子量等信息[15]。

　　近年來，隨著計算機技術的發展和數據處理模型的應用，分析超速離心數據處理程序越來越多，如： DCDT、Ultrascan、SEDFIT/SEDPHAT 等。本實驗室選擇的是由美國國立衛生研究院的 Peter Schuck 等研發的 SEDFIT/SEDPHAT 軟件，由于其高可靠性、易操作和高效率，已成為目前應用最為廣泛的分析軟件之一[16-17]。SEDFIT 主要用于沉降速率實驗數據的分析，本實驗室常用的是 Continuous c(s)Distribution Model，它利用 Lamm 方程模擬沉降邊界，代入方程進行求解，然后利用最小二乘法將全部數據進行優化擬合，從而得到溶質的具體信息。通過 c(s)即沉降系數分布模型計算結果可以得到各組分的分布比例、沉降系數以及擬合分子量等信息[18]。SEDPHAT 軟件主要用來分析沉降平衡實驗數據，當樣品沉降過程中達到平衡狀態時，根據 Lamm 方程可以得到更精確的分子量 M 值， SEDPHAT 軟件可以同時擬合多個濃度多個轉速的實驗數據，得到誤差率小于 2%的絕對分子量，此條件下要求實驗樣品足夠均一。SEDPHAT 軟件還可以用來分析蛋白質自聚集和相互作用實驗數據，計算解離常數。

　　3 分析超速離心技術在蛋白質研究中的應用

　　蛋白質是由氨基酸組成的有機大分子，作為生命活動的主要執行者，在基因表達調控、信號傳導以及疾病的預防與治療等方面發揮了重要作用。近年來，蛋白質科學研究發展迅速，新的蛋白質研究技術也不斷涌現。目前有多種方法可以對蛋白質性質和相互作用進行研究，如紫外、熒光、紅外等光譜儀可以分析蛋白質光學特性;瓊脂糖凝膠、高效液相色譜和質譜技術可以分析蛋白質分子質量;圓二色光譜儀可以分析蛋白質二級結構、三級結構;X-射線晶體學、冷凍電鏡以及核磁等技術可以分析蛋白質空間結構;表面等離子體共振技術(surface plasmon resonance, SPR)、等溫滴定微量熱技術(isothermal titration calorimetry, ITC)、微量熱泳動技術(microscale thermophoresis, MST)等可以檢測蛋白質間的相互作用。隨著分析超速離心技術的發展，其在蛋白質研究中的應用也更加廣泛，優勢也更加突出。從蛋白質均一性、分子量的測定，到蛋白質構象變化，再到蛋白質相互作用、結合比例的測定以及蛋白類生物類似藥的質量評價，分析超速離心技術在蛋白質性質分析方面發揮越來越重要的作用。

　　本文統計了近 30 年來分析超速離心技術相關的科研文獻，結果表明文章發表數量呈明顯上升趨勢。此外，統計數據表明蛋白質研究是分析超速離心技術應用的主要方面，2019 年發表的分析超速離心技術相關文章中，蛋白質研究占比 77%，遠高于分析超速離心技術在其他方面的應用，如圖 3 所示。本文主要介紹分析超速離心技術在蛋白質研究中不同方面的應用。

　　3.1 可溶性蛋白質性質的測定

　　可溶性蛋白質是指可以溶于水溶液的蛋白質，在水溶液中以分散態存在。分析超速離心技術對可溶性蛋白質的檢測分析，可以獲得多項表征蛋白質理化性質的信息，如沉降系數、分子量、摩擦系數以及軸長比等。

　　本實驗室利用分析超速離心技術研究了擬南芥 SnRK2.6(sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2.6)末端多聚酸性氨基酸序列對蛋白溶液性質的影響，并將多聚酸性氨基酸序列連接至擬南芥 PYL10 (PYR like protein 10)分子末端進行分析。通過 AUC 方法確認 SnRK2.6 蛋白在溶液中以單體形式存在，多聚酸性氨基酸序列會引起分子軸長比增加，水合半徑增大，分子排阻層析洗脫體積明顯變小，因此利用分子排阻層析法判斷蛋白質分子在溶液中的聚合狀態，需要非常謹慎[19]。

　　3.2 膜蛋白性質的測定

　　膜蛋白是生物功能的重要承擔者，在細胞間接觸、表面識別、信號傳導、酶活性和運輸等方面扮演著重要角色。在膜蛋白的純化過程中通常需要添加去垢劑來促進膜蛋白的溶解，而不同種類的去垢劑及其用量會對膜蛋白的理化性質、聚集狀態產生不同影響。分析超速離心技術可以測定膜蛋白-去垢劑復合物在離心過程中的沉淀行為，分析獲得其水力學參數，判斷膜蛋白在不同去垢劑中的均一性及聚集狀態。

　　γ-分泌酶是由 4 個亞單位組成的膜內蛋白水解酶，參與 β-淀粉樣前體蛋白的水解過程，在阿爾茲海默癥發病中扮演了重要角色。周瑞等使用分析超速離心技術對功能缺失的 γ-分泌酶突變體進行分析，發現 γ-分泌酶突變體在洋地黃皂苷(digitonin)、丙磺酸鹽(CHAPSO)去垢劑中具有不同的形態，在 digitonin 中是單體的狀態，而在 CHAPSO 中呈現寡聚的狀態[20]。

　　本實驗室發表的相關文章也闡述了分析超速離心技術在研究膜蛋白性質中的應用，文章以嗜熱菌來源的 ATP 結合轉運蛋白(ABC transporter)TmrAB 作為研究對象，利用 AUC 技術，研究其均一性、聚合狀態以及去垢劑與膜蛋白的摩爾比等性質。研究得到在去垢劑 DDM 濃度為 8 倍 CMC 條件下，TmrAB 以異二聚體的單體形式存在，狀態均一，DDM 與 TmrAB 的摩爾比為 116∶1，證明分析超速離心技術是一種測定膜蛋白分子量、研究膜蛋白聚合狀態的可靠手段[21]。

　　3.3 蛋白質自聚集分析

　　蛋白質自聚集是廣泛存在的一種蛋白質自相互作用現象，是生命活動中重要的調節機制。因其單組分的特性，導致蛋白質自聚集親和力分析具有一定的難度，如常見的 SPR、ITC、MST 等方法都只能用來測定不同蛋白質之間的相互作用。分析超速離心技術是為數不多的可以用來測定自聚集親和力的方法。SE 方法可以通過不同聚合模型的擬合來分析結合解離常數，適合分析樣品的動態聚集;SV 方法可以對不同濃度下實驗樣品的沉降系數分布進行整體分析，獲得樣品結合解離信息，測定從 pM 到 mM 的親和力[22-23]。

　　早在 20 世紀 30 年代，Shire 等就開始運用 SV 的方法分析不同濃度下蛋白質的聚集狀態[24]。在對 gp57A 自聚集現象的研究中，研究者也是利用 SV 方法最終確定了 gp75A 的聚合方式[25]。

　　本實驗室與美國國立衛生研究院 Peter Schuck 團隊合作開展的最新研究，以常見商用蛋白 β-lactoglobulin 的同型二聚作為模型，準確測定了其自聚集平衡結合常數，為蛋白質自聚集研究提供了一種完整的實驗技術方法。文章詳細介紹了蛋白質自聚集實驗中儀器校準、沉降速率設計、數據分析、結果統計評估等步驟，建立了一套應用分析超速離心技術研究蛋白質自聚集的標準方案，對 AUC-SV 方法在自聚集方面的應用提供了有效指導[26]。Yang 等利用上述方法研究了嗜乳脂蛋白 BTN3A1 的自聚集情況，其二聚體解離成單體的解離常數為 1.1 mM[27]。

　　隨著熒光檢測系統(fluorescence optical detection system，FDS)的應用開發，分析超速離心設備檢測靈敏度大大提升，FDS-SV 方法可以分析更高親和力的自聚集現象。Zhao 等利用谷氨酸受體 GluA2 氨基末端結構域作為高親和力同源二聚的模型，研究了熒光標記的選擇對自聚集結合常數的影響。結果表明， Dylight488 標記的 GluA2 和 EGFP 融合蛋白表達的 GluA2，解離常數與天然 GluA2 一致，分別為 20.5 nM 和 25.4 nM，而 FAM(5,6-羧熒光素)標記的 GluA2 解離常數約為 2.3 nM。此研究一方面說明 FDS-SV 可以進行 nM 級高親和力的測定，另一方面也提示應用 FDS-SV 需要選擇合適的標記方法才能得到更為準確的實驗結果[28]。

　　3.4 蛋白質與生物分子間相互作用的測定

　　蛋白質與生物分子間相互作用在信號通路、轉錄調控以及其他生命過程中發揮關鍵作用[29]。近年來，蛋白質與生物分子間相互作用方面的研究發展迅速，許多傳統和新興技術運用到分子相互作用的測定中[30]。分析超速離心技術的兩種實驗方法 SV 和 SE 均可應用在蛋白質與生物分子間相互作用的研究中。

　　SV 是通過樣品在不同濃度下得到的沉降系數分布對結果進行分析，隨著樣品濃度的變化沉降系數出現明顯偏移，說明在沉降過程中有相互作用發生。另外，SV 還可以完成多種信號的同時采集(multi-signal SV，MSSV)，對復合物的檢測分析更加完整。MSSV 可以通過混合物中不同組分的光譜特征去研究其各自的沉降系數分布，然后再進行整體分析，得出各個組分在混合物中的比例。與 SV 相比，SE 在蛋白質與生物分子相互作用研究中的應用時間更久，其明顯優勢在于可以同時記錄不同濃度、不同轉速下的樣品平衡情況，進行整體分析，得到更準確的測試結果[31]。

　　3.4.1 蛋白質間相互作用的測定

　　蛋白質間相互作用對細胞周期調控及信號傳導具有重要意義。分析超速離心技術的 SV 實驗可以分別將單獨的蛋白和蛋白復合物進行相同條件下的離心沉降，根據沉降系數、分子量的變化，判斷相互作用是否發生，調整復合物中不同蛋白質的比例，還可以獲得相互作用的化學計量比和解離常數。SE 實驗可以在不同樣品濃度、不同的轉速條件下檢測蛋白復合物的沉降平衡狀態，進而分析獲得蛋白相互作用的解離常數。EisemannT 等在對端錨聚合酶的研究中，通過 SV 和 SE 實驗，結合 ITC 檢測結果，證明了 TNKS(human tankyrase-1)和 GMD(GDP-mannose 4,6- dehydratase)是以 1∶1 比例結合，為蛋白復合物晶體樣品制備提供了重要參考信息[32]。Brown 等在 2008 年發表的方法學文章詳細描述了 SV 方法測定蛋白相互作用的基本原理、實驗內容、數據處理等具體信息[33]。Zhao 等正是利用該方法結合熒光檢測系統，成功測定了 20.5 pM 的抗體與 FGFP 親和力，進一步提高了 SV 方法在親和力方面的檢測范圍[34]。

　　3.4.2 蛋白質與核酸相互作用的測定

　　蛋白質與核酸的相互作用存在于生物體的多個生命過程中，如 DNA 的復制、修復、轉錄、翻譯以及反轉錄等，分析超速離心技術也可以用于蛋白質與核酸相互作用的研究。Philo 等在研究雞卵溶菌酶與 DNA/RNA 配體的相互作用中，應用 AUC-SV 方法，結合熒光偏振和 ITC 技術進行分析，證明了此相互作用具有靜電特征，鹽濃度和溫度的變化都會引起親和力改變[35]。Ortega 等同時運用分析超速離心技術的 SV 和 SE 兩種方法研究表明，在無光照情況下 AdoB12 可以誘導 TtCarH 形成四聚體，四聚體 TtCarH 可以結合 DNA[36-37]。

　　3.4.3 小分子誘導蛋白質間相互作用的測定

　　小分子通常是指分子量小于 1 000 Da 的分子，如多肽、植物激素、金屬離子、藥物分子等。小分子通過誘導蛋白質間相互作用參與多種生命活動，如植物激素調節、信號傳導等。植物磺肽素(phytosulfokine， PSK)是一種含兩個酪氨酸磺化修飾的五肽激素，在植物體中作為信號分子調節植物的生長發育。王繼縱等于 2015 年在對植物磺肽素的研究中，通過 SV 實驗分別檢測了存在或缺失 PSK 的情況下，體細胞胚胎是否發生受體樣激酶( SERK ) 和 PSK 受體激酶 (PSKRLRR)異二聚化沉降行為，結果表明 PSK 可以誘導 PSKR 與 SERK 發生異源二聚[38]。

　　3.5 蛋白質結構解析的應用

　　在結構生物學研究中，蛋白質樣品的準備過程影響著樣品的質量，如蛋白質的聚集狀態、均一性、單分散程度等，進而影響小角散射、X 射線衍射、核磁共振或冷凍電鏡等結構生物學方法的實驗測定結果。利用分析超速離心技術，可以協助判斷不同條件下蛋白質樣品的質量，有助于節省后續實驗時間和成本。

　　另外，分析超速離心技術還可以與小角散射(SAS)技術聯用，幫助解析蛋白質結構。用于 SAS 的樣品通常是高度純化和單分散的，但也存在輕微的聚集擾亂數據質量，去除聚集物的影響是 SAS 技術面臨的重大挑戰。分析超速離心技術可以獲得溶液中各組分濃度的分布信息，將多組分溶液的 SAS 信號強度進行分解。Morishima 等在最新的研究中采取 AUC-SAS 聯用方法，成功分析了含有高聚體的溶液中特定單體的 SAS信號強度以及弱相互作用體系中復合物的 SAS信號強度，有利于后續的蛋白結構解析過程[39]。

　　3.6 蛋白質構象變化分析

　　蛋白質構象變化在生物信號傳導中發揮重要作用。Kreiner 等利用分析超速離心對 FIII9′-10 進行分析發現，不同構象的 FIII9′-10 蛋白的沉降系數存在明顯差異，說明分析超速離心方法是測定蛋白構象變化的有效手段[40]。

　　在最新發表的文章中，Brautigam 等利用分析超速離心技術，以牛血清蛋白(BSA)和突變的葡萄糖結合蛋白(TpMglB-2WA)為研究對象，驗證了沉降速率法和差異沉降速率法( difference sedimentation velocity，DSV)可以有效地檢測蛋白質構象變化[41]。結果表明，4%重水可以引起 BSA 構象變化;D-葡萄糖可以誘導 TpMglB-2WA 蛋白的構象變化，與晶體結構數據一致[42]。Brautigam 等同時開發了免費專業軟件 DiSECT，用于處理 DSV 實驗數據，可以有效地降低噪音信息，獲得微小的沉降系數差，進一步提升了數據處理與分析能力。此成果將有效推動分析超速離心技術在檢測蛋白質構象變化方面的應用。

　　3.7 蛋白質藥物的應用

　　近年來，蛋白質藥物發展迅速，在一些疾病治療方面顯示出明顯優勢。蛋白質藥物聚集體會引起患者的不良免疫反應，蛋白質藥物的聚集狀態是影響藥物質量的關鍵指標。分析超速離心技術可以在溶液狀態下對蛋白質藥物制品進行直接測定，得到更加精準的實驗結果，被越來越多地應用在醫藥研發中。

　　凝血因子Ⅷ(fVIII)是治療 A 型血友病的有效藥物，重組 fVIII 蛋白往往具有一定的免疫原性，被次氯酸鹽氧化后的重組 fVIII 免疫原性增強。為了研究氧化誘導的免疫原性和分子聚集之間的潛在聯系， Zakas 等通過分析超速離心技術對氧化前后的重組 fVIII 產品 Helixate 進行分析，結果表明氧化誘導的免疫原性不用于聚集介導的免疫反應，為 fVIII 免疫原性機制的多樣性研究提供了有力證明[43]。

　　隨著原研蛋白類生物藥專利到期，蛋白類生物類似藥研發成為醫藥研發的重要方向。在蛋白類生物類似藥申報中，聚集體的檢測作為一項重要指標，在進行蛋白類生物類似藥一致性評價時非常關鍵。FDA 在蛋白類生物類似藥指導原則中提出須使用多種分析方法來評估同一性質，建議使用分析型超速離心技術(AUC)與尺寸排阻色譜(SEC)等方法共同檢測分析藥物聚集體，但 SEC 通常無法檢出非共價結合的低聚物。AUC 技術檢測樣品不需要標準品和標記物，也不需要與基質相互作用，檢測器的高靈敏度使得檢測結果更精準，已成為 FDA 檢測蛋白藥物非共價聚集的“金標準”。

　　4 展望

　　基于扎實的熱力學和流體力學理論，分析超速離心技術在蛋白質研究中得到越來越廣泛的應用，但也存在一定的局限性。分析超速離心技術要求被檢測樣品純度高、濃度適宜，對于細胞裂解液、血漿、尿液等含有高濃度、復雜成分的樣品無法直接測量。在檢測生物分子間相互作用的應用中，與 ITC、SPR、MST 等技術相比，分析超速離心技術所需測試時間較長(從 SV 實驗的幾小時到 SE 實驗的幾十小時)，因此對蛋白質穩定性要求較高。

　　隨著熒光檢測器的發展和數據處理軟件的優化，有望實現對高濃度樣品或復雜成分樣品的有效檢測。目前已有部分應用案例如對高濃度的單克隆抗體以及模擬的人血漿樣品的測試分析[44]。分析超速離心機還可以進一步整合其他檢測手段，如光散射檢測法，擴展分析超速離心技術的應用范圍。此外，目前的分析超速離心數據處理軟件操作繁雜，進一步優化數據處理過程，也是未來的發展方向之一。