作者：唐迪 趙婷 仰榴青 單位：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院

釀酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn));甲醇為上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，色譜純;其他試劑均為市售分析純。料處理釀酒葡萄渣在60℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘24h，粉碎后過40目篩，置干燥器中備用。白藜蘆醇的提取［13－15］精密稱取30g釀酒葡萄渣原料，以80%乙醇作為提取溶劑，液料比為10mL∶1g，提取溫度為60℃，共提取3次，每次提取時間為2h，第2、3次提取前各超聲10min，合并3次所得濾液，在40℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得釀酒葡萄渣提取樣品。

樣品預(yù)凈化處理(1)白藜蘆醇的定性鑒定。白藜蘆醇在365nm處顯藍紫色熒光。用薄層層析法檢測，展開劑為三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)時，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品Rf值=0．638定性鑒定白藜蘆醇的存在，從而能有效控制預(yù)處理過程。點樣:取活化好的硅膠GF254板，薄層板尺寸為:10cm×20cm，距薄板一端約1．5cm處，用鉛筆輕輕劃1條與底邊平行的直線，確定各樣品點樣位置。然后分別用毛細管吸取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、釀酒葡萄渣溶液進行點樣。樣點之間的距離約1cm，薄層兩邊距離約1cm。展開:將點樣好的薄層板置于展開劑中，上行展開15cm，取出，揮干溶劑。檢測:在365nm紫外燈下觀察熒光斑點。(2)樣品預(yù)凈化處理。準(zhǔn)確吸取0．5mL提取樣品，加樣于硅膠柱上(硅膠10g，硅膠柱為10mm×250mm的玻璃柱，濕法裝柱)。用約35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)洗脫，依據(jù)上述方法跟蹤鑒定，收集白藜蘆醇組分，濃縮至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm濾膜過濾得樣品溶液。平行處理3個樣品，待HPLC測定。1．3．4白藜蘆醇含量測定(1)檢測波長的選擇。以甲醇作為溶劑空白，在220～400nm處對白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行掃描，確定白藜蘆醇的最大吸收波長。(2)HPLC色譜分析條件。色譜條件:色譜柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流動相－甲醇－水(體積比45∶55);流速0．8mL/min;柱溫35℃;檢測波長:306nm;色譜工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外標(biāo)曲線的測定。準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇－水(體積比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分別從中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分別定容至10mL，用0．45μm濾膜過濾，得濃度分別為1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件下進樣10μL，平行測定3次，求其峰面積的平均值，計算得外標(biāo)曲線。(4)釀酒葡萄渣中白藜蘆醇含量測定。將“1．3．3”預(yù)凈化處理過的樣品進樣20μL，平行測定3次，計算白藜蘆醇的峰面積，根據(jù)外標(biāo)曲線求出白藜蘆醇的含量。

檢測波長的選擇白藜蘆醇的紫外吸收光譜圖見圖1。可見最大吸收波長為306nm，與前人研究結(jié)果一致，故本研究選擇306nm為檢測波長。

外標(biāo)曲線的確定白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖見圖2。以對照品進樣量(μg)x對峰面積積分值y進行線性回歸，結(jié)果表明，白藜蘆醇在0．0165～0．0825μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程為y=7×106x－82231(r=0．9999)。

重現(xiàn)性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，平行5份，測定白藜蘆醇的峰面積，其5次測定的RSD為4．8%，重現(xiàn)性好。

穩(wěn)定性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，精密吸取同一樣品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分別進樣測定峰面積，RSD為1.2%(n=9)，可見樣品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗加20μg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品于釀酒葡萄渣樣品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法處理樣品并進行HPLC測定，每個樣品平行測定3次，求平均峰面積，根據(jù)外標(biāo)曲線計算加樣回收率。5次測定的白藜蘆醇的回收率為94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率為98．9%，RSD為5.04%(n=5)。

釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量測定釀酒葡萄渣預(yù)處理樣品的HPLC圖譜見圖3。經(jīng)過一步硅膠柱預(yù)處理，不僅白藜蘆醇得到了富集，且白藜蘆醇峰與其他雜質(zhì)峰得以完全分離，無雜質(zhì)峰干擾，預(yù)處理凈化效果好。試驗測得河北釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量為6．482μg/g干葡萄渣，而新疆釀酒葡萄渣中未檢測到白藜蘆醇。

采用一步硅膠柱預(yù)處理方法可用于釀酒葡萄渣中白藜蘆醇含量的HPLC測定，線性回歸方程為y=7×106x－82231(r=0．9999)，線性范圍為0．0165～0．0825μg，精密度和重現(xiàn)性好，平均加樣回收率為98．9%，RSD為5．04%(n=5)。測得河北釀酒葡萄渣提取物預(yù)處理樣品中白藜蘆醇的含量為6．482μg/g，新疆釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量甚微，HPLC無法檢測。HPLC方法簡便，快速，可用于白藜蘆醇的定量分析。

由于葡萄渣中白藜蘆醇的含量少，釀酒葡萄渣提取物用硅膠柱預(yù)處理效果好，可有效去除影響色譜柱使用壽命的脂溶性雜質(zhì)，也使白藜蘆醇得到了富集，能進行HPLC測定。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量不同，可能與釀酒工藝及葡萄的品種有關(guān);釀酒后的葡萄渣中白藜蘆醇的含量低于相關(guān)資料的鮮食葡萄皮中的含量，與葡萄酒中白藜蘆醇的含量較高相吻合。